माउस के पृष्ठीय skinfold चैंबर में इस्कीमिक ऊतक चोट: एक त्वचा प्रालंब मॉडल तीव्र लगातार Ischemia जांच
Summary
प्रस्तुत murine पृष्ठीय skinfold कक्ष की खिड़की एक musculocutaneous फ्लैप की तीव्र लगातार ischemia के एक क्षेत्र visualizes. Microvasculature और hemodynamics की मात्रा का ठहराव के प्रत्यक्ष और दोहराव आकलन के लिए intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परमिट. शब्द के भागों और hemodynamic परिणाम आगे ऊतकीय और आणविक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है.
Abstract
गहन विशेषज्ञता और उन्नत सर्जिकल तकनीकों के बावजूद, व्यापक ऊतक परिगलन को घाव टूटने से लेकर ischemia प्रेरित जटिलताओं अभी भी विशेष रूप से पुनर्निर्माण फ्लैप सर्जरी में, होने वाली हैं. एकाधिक प्रयोगात्मक फ्लैप मॉडल मूल कारणों और तंत्र का विश्लेषण करने के लिए और इस्कीमिक जटिलताओं को रोकने के लिए उपचार रणनीतियों की जांच करने के लिए विकसित किया गया है. अधिकांश मॉडल के सीमित कारक सीधे और repetitively microvascular वास्तुकला और hemodynamics कल्पना करने कमी संभावना है. प्रोटोकॉल के लक्ष्य के इन पहले उल्लेख कमी तत्वों सम्बद्ध एक सुस्थापित माउस मॉडल पेश करने के लिए था. कठिन एट अल. अनुपचारित रखा अगर 10 दिनों के बाद 50% गल जाना ~ में तीव्र लगातार ischemia और परिणाम आए है कि एक यादृच्छिक छिड़काव पैटर्न के साथ एक musculocutaneous फ्लैप का एक मॉडल विकसित किया है. Intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की सहायता के साथ, इस चैम्बर मॉडल का दोहराव दृश्य की अनुमति देताआकृति विज्ञान और समय के साथ ब्याज के विभिन्न क्षेत्रों में hemodynamics. ऐसे एपोप्टोसिस, सूजन, microvascular रिसाव और angiogenesis के रूप में जुड़े प्रक्रियाओं की जांच की और immunohistochemical और आणविक प्रोटीन assays के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है. तिथि करने के लिए, मॉडल ischemically चुनौती दी ऊतक के पूर्व, पेरी के प्रभाव और postconditioning की जांच कई प्रकाशित प्रयोगात्मक अध्ययन में व्यवहार्यता और reproducibility साबित कर दी है.
Introduction
पुनर्निर्माण सर्जरी में उजागर कण्डरा, हड्डी और प्रत्यारोपण सामग्री की कवरेज फ्लैप के उपयोग पर निर्भर करता है. एक फ्लैप धमनी प्रवाह और शिरापरक बहिर्वाह की गारंटी देता है कि अपने संवहनी डंडी पर स्थानांतरित किया है कि ऊतक का एक ब्लॉक है. व्यापक विशेषज्ञता और स्थानांतरित करने के लिए फ्लैप की एक किस्म की उपलब्धता के बावजूद, कुल ऊतकों को नुकसान के लिए घाव टूटने से लेकर ischemia प्रेरित जटिलताओं अभी भी सामना कर रहे हैं. माध्यमिक इरादे से रूढ़िवादी उपचार और चिकित्सा नाबालिग ऊतक परिगलन के बाद उम्मीद की जा सकती है, जबकि महत्वपूर्ण फ्लैप परिगलन आमतौर पर क्षतशोधन, घाव कंडीशनिंग और माध्यमिक पुनर्निर्माण सहित शल्य संशोधन की आवश्यकता है. यह रुग्णता बढ़ जाती अस्पताल में रहने prolongs और फलस्वरूप वृद्धि की स्वास्थ्य देखभाल की लागत की ओर जाता है.
धमनी आमद से सबसे दूरस्थ बाहर का क्षेत्र में एक vasculature की अपरिभाषित पैटर्न या बेतरतीब ढंग से perfused क्षेत्रों के साथ फ्लैप इस्कीमिक क्षति के लिए विशेष रूप से ग्रस्त हैं. लेखा rdingly, कई प्रयोगात्मक और नैदानिक अध्ययन दोनों में नेक्रोसिस के विकास का मूल्यांकन किया है, अक्षीय पैटर्न फ्लैप (परिभाषित रक्त की आपूर्ति) और यादृच्छिक पैटर्न फ्लैप (अपरिभाषित रक्त की आपूर्ति) 1-3. मुख्य निष्कर्ष सामान्यतः परिगलित क्षेत्र के आकार के macroscopic मूल्यांकन के आधार पर कर रहे हैं. कारणों और ऊतक परिगलन के तंत्र का आकलन करने के क्रम में और अधिक विस्तार में, कई अध्ययनों microcirculation के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया. विभिन्न तकनीकों polarographic इलेक्ट्रोड 4-5 का उपयोग ऊतक ऑक्सीजन तनाव का विश्लेषण, साथ ही लेजर डॉपलर Flowmetry 6-7, डाई प्रसार 8, और microspheres के 9-10 का उपयोग रक्त प्रवाह की माप सहित, ऊतक छिड़काव को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तकनीकों में, तथापि, केवल ऊतक छिड़काव की अप्रत्यक्ष मापदंडों को मापने के लिए अनुमति देते हैं और एक फ्लैप के हित के एक व्यक्ति के क्षेत्र के भीतर microhemodynamic प्रक्रियाओं के किसी भी रूपात्मक विश्लेषण सक्षम नहीं है.
टी "> संडिसन वह खरगोश 11 में प्रदर्शन किया जो vivo अध्ययन में लंबे समय तक के लिए एक पारदर्शी चैम्बर इस्तेमाल किया गया है जो पहले हो जाता है 1943 में -. लगभग 20 साल बाद – Algire लागू होने के लिए इस तरह के एक पारदर्शी चैम्बर अनुकूलित करने के लिए पहली बार था ट्यूमर कोशिकाओं 12 की सूक्ष्म प्रत्यारोपण के व्यवहार का अध्ययन करने के क्रम में चूहों में. कारण चूहों ढीली त्वचा जानवरों तथाकथित कर रहे हैं और बाद के वर्षों में कुछ तकनीकी शोधन के बाद, लेहर और सह कार्यकर्ताओं ऐसे अनुकूलित करने में सक्षम थे कि इस तथ्य को एक छोटे और लाइटर टाइटेनियम कक्ष विकासशील एक पृष्ठीय skinfold चैम्बर. यह चैम्बर intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, एक शब्द के भागों और microcirculatory सुविधाओं की संख्या और विभिन्न शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत समय के साथ अपने में परिवर्तन का सीधा और दोहराव दृश्य की अनुमति देता है कि एक तकनीक है, इस तरह का प्रयोग कर मूल्यांकन सक्षम ischemia-reperfusion की चोट के रूप में 13.पीई की जांच मेंसामान्य और रोग की स्थिति के तहत त्वचा, मांसपेशियों और हड्डियों फ्लैप के rfusion दो प्रवृत्तियों हुई: पहला, ऐसे माउस 14 में pedicled कान फ्लैप के रूप में पृष्ठीय skinfold कक्ष का उपयोग नहीं करते कि "गंभीर" फ्लैप मॉडल, पार्श्व आधारित द्वीप त्वचा फ्लैप हैम्स्टर 15 और चूहे 16 में pedicled समग्र फ्लैप में. दूसरा, एक पृष्ठीय skinfold कक्ष परमिट दोहराव microcirculatory साथ एक फ्लैप के संयोजन intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ कई दिनों से अधिक का विश्लेषण करती है, जहां "पुरानी" फ्लैप मॉडल. यह माउस 17 की skinfold कक्ष में एकीकृत है कि एक बेतरतीब ढंग से perfused musculocutaneous फ्लैप के होते हैं. इसकी चौड़ाई से लंबाई अनुपात तीव्र लगातार ischemia के एक स्थिति लगातार 10 से 14 दिनों के फ्लैप पदोन्नति के बाद 50% फ्लैप ऊतक परिगलन ~ में यह परिणाम है कि चुना गया था. ऊतक परिगलन की यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हद, सुरक्षात्मक (यानी, के विकास लेस दोनों के आगे मूल्यांकन की अनुमति देता हैएस गल जाना) और हानिकारक कारकों (यानी, फ्लैप pathophysiology पर अधिक परिगलन का विकास). पिछले वर्षों के दौरान, विभिन्न पेरी पूर्व, और ऊतक-सुरक्षात्मक पदार्थ 18-24 के प्रशासन और ऐसी गर्मी 25 और आश्चर्य 26 के रूप में शारीरिक तनाव के स्थानीय आवेदन सहित पद कंडीशनिंग प्रक्रियाओं, के प्रभाव का प्रदर्शन कई प्रयोगात्मक प्रकाशनों, उभरा है.
गल जाना, microvascular आकृति विज्ञान और microcirculatory मापदंडों का मात्रात्मक विश्लेषण आगे immunohistochemical विश्लेषण और प्रोटीन assays के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है. संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), नाइट्रिक ऑक्साइड synthases (ओपन स्कूल), परमाणु कारक कापा बी (एनएफ-κB) और गर्मी झटका प्रोटीन (HSP-32 सहित विभिन्न प्रोटीन और अणुओं: हीम-oxygenase 1 (हो-1) और HSP- 70) ऊतक संरक्षण में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. इस कक्ष फ्लैप मॉडल के आधार पर, दो संशोधनों orde में विकसित किया गया हैआर अक्षीय पैटर्न छिड़काव 28 के साथ एक pedicled फ्लैप में त्वचा भ्रष्टाचार चिकित्सा 27 और एन्जियोजेनिक घटनाक्रम के दौरान neovascularization और microcirculation का विश्लेषण करने के लिए. हम माउस skinfold कक्ष में एक ischemically चुनौती दी musculocutaneous फ्लैप भी शामिल है कि एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय मॉडल प्रस्तुत करते हैं. इस मॉडल intravital महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा microcirculation और hemodynamics के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
नैदानिक परिणाम इस्कीमिक जटिलताओं को कम करने और इस तरह सुधार करने के लिए, समीक्षकों perfused फ्लैप ऊतक में pathophysiologic प्रक्रियाओं का अधिक विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता है. तीव्र लगातार ischemia के नकल कि नए पशु मॉडल का व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम छवि संपादन के लिए Katharina Haberland धन्यवाद. अनुदान: वरिष्ठ लेखक एक नए शोध प्रयोगशाला स्थापित करने के लिए Technische Universität München से एक KKF अनुदान प्राप्त किया.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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