Iskemisk skade på kroppsvev i Dorsal skinfold Chamber of Mouse: A Skin Flap modell for å undersøke Akutt Vedvarende Ischemia
Summary
Vinduet av det murine dorsal skinfold kammeret presentert visualiserer en sone av akutt iskemi vedvarende over en musculocutaneous klaff. Intra epi-fluorescens mikrostillatelse for direkte og repeterende vurdering av microvasculature og kvantifisering av hemodynamics. Morfologisk og hemodynamiske resultater kan videre være korrelert med molekyl og histologiske analyser.
Abstract
Til tross for dyp ekspertise og avanserte kirurgiske teknikker, er iskemiindusert komplikasjoner som spenner fra sår sammenbrudd til omfattende vevsnekrose fortsatt skjer, spesielt i rekonstruktiv klaff kirurgi. Flere eksperimentelle klaff modeller har blitt utviklet for å analysere underliggende årsaker og mekanismer, og for å undersøke behandlingsstrategier for å hindre iskemiske komplikasjoner. Den begrensende faktoren for de fleste modeller er den manglende muligheten til direkte og gjentatte ganger visualisere microvascular arkitektur og hemodynamics. Målet med protokollen var å presentere et veletablert musemodell affiliating disse før nevnte mangler elementer. Hardere et al. Har utviklet en modell av et musculocutaneous klaff med en tilfeldig perfusjon mønster som gjennomgår vedvarende akutt iskemi og resulterer i nekrose ~ 50% etter 10 dager hvis holdt ubehandlet. Ved hjelp av intravital epi-fluorescensmikroskopi, tillater dette kammer repeterende visualisering av modellenmorfologi og hemodynamics i ulike regioner av interesse over tid. Tilhørende prosesser slik som apoptose, inflammasjon, angiogenese, mikrovaskulær lekkasje og kan undersøkes og korrelert til immunohistokjemiske og molekylære assays protein. Til dags dato har modellen vist seg gjennomførbarhet og reproduserbarhet i flere publiserte eksperimentelle studier som undersøker effekten av pre-, peri- og postconditioning av ischemisk utfordret vev.
Introduction
Dekning av eksponert sene, ben og implantat materiale i rekonstruktiv kirurgi er avhengig av bruk av flaps. En klaff er en blokk med vev som er overført på sin vaskulær pedicle som garanterer arteriell tilsig og venøs utstrømning. Til tross for bred kompetanse og tilgjengeligheten av en rekke klaffer som skal overføres, er iskemiindusert komplikasjoner som spenner fra sår sammenbrudd til total vevstap fortsatt støtt. Mens konservativ behandling og helbredelse ved sekundær intensjon kan forventes etter mindre vevsnekrose, betydelig klaff nekrose krever vanligvis kirurgisk revisjon, inkludert debridement, sår condition og sekundær rekonstruksjon. Dette øker sykelighet, forlenger sykehusopphold og dermed fører til økte helsekostnader.
Flaps med ubestemt mønster av blodkar eller tilfeldig perfuserte områder i distal sone mest fjernt fra den arterielle tilsig er spesielt utsatt for iskemisk skade. Acco rdingly, har mange eksperimentelle og kliniske studier evalueres utvikling av nekrose i begge, aksial mønster flaps (definert blodforsyning) og tilfeldig mønster flaps (udefinert blodforsyning) 1-3. Hovedresultatene er vanligvis basert på makroskopisk evaluering av størrelsen av det nekrotiske området. For å vurdere de årsaker og mekanismer for vevsnekrose mer i detalj, flere studier fokusert på analyse av mikrosirkulasjonen. Forskjellige teknikker er blitt brukt til å måle vevsperfusjon, inkludert analyse av vev oksygenspenning ved hjelp av elektroder polarographic 4-5, så vel som måling av blodstrømmen ved hjelp av laser-Doppler-strømningsmåling 6-7, fargestoff diffusjon 8, og mikrokulene 9-10. Disse teknikkene er imidlertid bare tillate for indirekte måling av parametere av vevsperfusjon og ikke aktiverer noen morfologisk analyse av de microhemodynamic prosesser innen en individuell område av interesse av en klaff.
t "> Sandison er kjent for å være den første som har brukt en gjennomsiktig kammer for langvarig in vivo studier, som han utførte i kaniner 11 I 1943 -. ca 20 år senere – Algire var den første til å tilpasse seg en slik gjennomsiktig kammer å være aktuelt i mus for å studere oppførselen til mikroimplantater av 12 tumorceller. På grunn av det faktum at mus er såkalte løs hud dyr, og etter noen tekniske finesser i løpet av de neste årene, Lehr og medarbeidere var i stand til å tilpasse seg slike en dorsal skinfold kammer utvikle en mindre og lettere titan kammeret. Dette kammeret aktivert evaluering ved hjelp av intravital fluorescens mikroskopi, en teknikk som gjør det mulig direkte og repeterende visualisering av et antall morfologiske og microcirculatory egenskaper og deres endringer over tid under forskjellige fysiologiske og patofysiologiske betingelser, for eksempel som iskemi-reperfusjonsskade 13.I etterforskningen av perfusion av hud, muskel og bein flaps under normale og patologiske tilstander to trender skjedde: Først den "akutte" klaff modeller som ikke bruker rygg skinfold kammeret som pedicled øret klaff i muse 14, den lateralt basert øya hud klaff i hamster 15 og pedicled kompositt klaffen i rotte 16. Det andre, "kronisk" klaff modell der kombinasjonen av en klaff med en rygg skinfold kammer tillatelser repetitive microcirculatory analyser over flere dager med intra fluorescens mikroskopi. Den består av en tilfeldig perfusert musculocutaneous klaff som er integrert i skinfold kammeret av musen 17.. Dens bredde-til-lengde-forholdet ble valgt som en situasjon med vedvarende akutt iskemi gående resulterer i ~ 50% klaff vevsnekrose 10 til 14 dager etter klaff høyde. Denne reproduserbar omfanget av vevsnekrose tillater ytterligere evaluering av begge, beskyttende (dvs. utvikling av less nekrose) og skadelige faktorer (dvs. utvikling av mer nekrose) på klaff patofysiologi. I løpet av de siste årene, flere eksperimentelle publikasjoner som viser effekten av ulike pre-, peri- og post-condition prosedyrer, inkludert administrasjon av vev-beskyttende stoffer 18-24 og lokal påføring av fysiologiske stressfaktorer som varme 25 og sjokkbølger 26, har dukket opp.
De kvantitative analyser av nekrose, mikrovaskulær morfologi og microcirculatory parametere kan videre være korrelert til immunhistokjemiske analyser og proteinanalyser. Forskjellige proteiner og molekyler inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), nitrogenoksid synthases (NOS), nukleær faktor kappa B (NF-kB) og varmesjokkproteiner (HSP-32: hem oksygenase-1 (HO-1) og HSP- 70) er blitt vist å spille en rolle i vev beskyttelse. Basert på denne modellen kammerklaffen, er det utviklet to modifikasjoner i order å analysere neovascularization og mikrosirkulasjonen under huden pode healing 27 og angiogeniske utviklingen i et pedicled klaff med aksial mønster perfusjon 28. Vi presenterer en reproduserbar og pålitelig modell som inkluderer en ischemisk utfordret musculocutaneous klaff i muse skinfold kammeret. Denne modellen gjør det mulig for visualisering og kvantifisering av mikrosirkulasjonen og hemodynamics av intra epi-fluorescens mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å redusere ischemiske komplikasjoner, og derved forbedre klinisk resultat, er mer detaljert kjennskap til patofysiologiske prosesser i kritisk perfusert klaff vev nødvendig. Utviklingen av nye dyremodeller som etterligner akutt vedvarende iskemi er derfor obligatorisk. Følgelig var vi i stand til å utvikle en lett reproduserbar og pålitelig modell som åpner for repeterende morfologiske, dynamisk og funksjonell sanntid evaluering av ulike parametere av muskel og hud blodkar som kan korrelerte med immunhistokjem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Katharina Haberland for bilderedigering. Finansiering: senior forfatter mottatt en KKF Grant fra Technische Universität München for å sette opp et nytt forskningslaboratorium.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
