Ischemisk Tissue Skada i Dorsal skinfold avdelning Mus: En Skin Flap modell för att undersöka Akut Ihållande Ischemi
Summary
Fönstret i murina rygg skinfold kammare presenteras visualiserar en zon av akut ihållande ischemi av en musculocutaneous flik. Intravital epi-fluorescens mikroskopi tillstånd för direkt och upprepad bedömning av mikrocirkulation och kvantifiering av hemodynamik. Morfologiska och hemodynamiska resultat kan vidare korreleras med histologiska och molekylära analyser.
Abstract
Trots djup expertis och avancerade kirurgiska tekniker, är ischemi-inducerade komplikationer allt från lindad nedbrytning omfattande vävnadsdöd fortfarande förekommer, särskilt i rekonstruktiv klaffkirurgi. Flera experimentella klaff modeller har utvecklats för att analysera bakomliggande orsaker och mekanismer och undersöka behandlingsstrategier för att förhindra ischemiska komplikationer. Den begränsande faktorn för de flesta modeller är den saknade möjlighet att direkt och repetitivt visualisera mikrovaskulära arkitektur och hemodynamik. Målet med protokollet var att presentera en väl etablerad musmodell affiliating dessa tidigare nämnts saknar element. Harder et al. Har utvecklat en modell av en musculocutaneous flik med ett slumpmässigt perfusion mönster som genomgår akut ihållande ischemi och resulterar i ~ 50% nekros efter 10 dagar om de förvaras obehandlade. Med hjälp av intravital epi-fluorescens mikroskopi, ger detta kammarmodell repetitiva visualisering avmorfologi och hemodynamik i olika regioner av intresse över tiden. Associerade processer såsom apoptos, inflammation, mikrovaskulära läckage och angiogenes kan undersökas och korreleras till immunhistokemiska och molekylära proteinanalyser. Hittills har modellen visat genomförbarhet och reproducerbarhet i flera publicerade experimentella studier som undersöker effekten av pre-, peri- och postconditioning av ischemiskt utmanade vävnad.
Introduction
Täckning av exponerade senor, ben och implantatmaterial i rekonstruktiv kirurgi bygger på användning av klaffar. En flik är ett block av vävnad som överförs på sin vaskulära pedicle som garanterar arteriell inflöde och venösa utflödet. Trots en bred kompetens och tillgång till en mängd olika flikar som ska överföras, är ischemi-inducerade komplikationer allt från lindad nedbrytning till total vävnadsförlust fortfarande påträffas. Av följande skäl kan förväntas konservativ behandling och läkning av sekundär intention efter mindre vävnadsnekros, signifikant klaff nekros kräver vanligen kirurgisk revision, inklusive debridering, lindad konditionering och sekundär rekonstruktion. Detta medför ökad sjuklighet, förlänger sjukhusvistelse och därmed leder till ökade vårdkostnader.
Flikar med en odefinierad mönster av kärl eller slumpmässigt perfusion områden i distala zonen längst bort från arteriell inflöde är speciellt benägna att ischemisk skada. Acco rdingly har många experimentella och kliniska studier bedömt utvecklingen av nekros i båda, axiell mönsterflikar (definierad blodförsörjnings) och slumpmässiga mönster flikar (odefinierat blod leverans) 1-3. De viktigaste resultaten är ofta baserade på makroskopisk bedömning av storleken på det nekrotiska området. För att kunna bedöma orsakerna till och mekanismerna för vävnadsnekros mer i detalj, flera studier fokuserat på analys av mikrocirkulationen. Olika tekniker har använts för att mäta vävnadsperfusion, inklusive analys av vävnadssyrespänningen med hjälp polarografiska elektroder 4-5, samt mätning av blodflödet med hjälp av laser Doppler flowmetry 6-7, färgdiffusion 8, och mikrosfärer 10/09. Dessa tekniker är dock endast tillåta för att mäta indirekta parametrar för vävnadsperfusion och gör det inte möjligt någon morfologisk analys av de microhemodynamic processer inom ett enskilt område av intresse i en flik.
t "> Sandison är känd för att vara den första som har använt en transparent kammare för förlängd in vivo studier, som han på kaniner 11 1943 -. ca 20 år senare – Algire var först med att anpassa en så transparent kammare att gälla i möss för att studera beteendet hos mikro implantat av tumörceller 12. På grund av det faktum att möss är så kallade lös hud djur och efter en del tekniska förbättringar under de följande åren, Lehr och medarbetare kunde anpassa sådana en dorsal skinfold kammare utveckla en mindre och lättare titan kammaren. Denna kammare aktiverat utvärdering med intravital fluorescensmikroskopi, en teknik som möjliggör direkt och repetitiva visualisering av ett antal morfologiska och mikrocirkulatoriska och dess förändring över tid under olika fysiologiska och patofysiologiska förhållanden, såsom såsom ischemi-reperfusionsskada 13.I utredningen av perfusion av hud, muskler och ben klaffar under normala och patologiska tillstånd två trender inträffat: Först de "akuta" klaffmodeller som inte använder rygg skinfold kammaren såsom pedicled öronfliken i musen 14, den i sidled baserad ön hudfliken i hamster 15 och pedicled sammansatta klaffen i råtta 16. För det andra, den "kroniska" klaff modell där kombinationen av en flik med en dorsal skinfold kammaren tillåter repetitiv blodcirkulationens analyser över flera dagar med intravital fluorescensmikroskopi. Den består av ett slumpmässigt perfunderad musculocutaneous flik som är integrerad i skinfold kammaren av musen 17. Dess bredd-längdförhållande valdes att en situation av akut ihållande ischemi leder konsekvent ~ 50% klaff vävnadsnekros 10 till 14 dagar efter klaff höjd. Denna reproducerbar omfattning vävnadsnekros möjliggör ytterligare utvärdering av båda, skyddande (dvs utveckling av less nekros) och skadliga faktorer (dvs utveckling av mer nekros) på klaff patofysiologi. Under de senaste åren har flera experimentella publikationer som visar effekten av olika pre-, peri- och postkonditioneförfaranden, inbegripet förvaltning av vävnadsskyddande ämnen 18-24 och den lokala tillämpningen av fysiologiska stressfaktorer såsom värme 25 och chockvågor 26, har uppstått.
De kvantitativa analyser av nekros, mikrovaskulära morfologi och mikrocirkulatoriska parametrar kan dessutom korreleras till immunhistokemiska analyser och proteinanalyser. Olika proteiner och molekyler inklusive vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), kväveoxidsyntaser (NOS), nukleär faktor kappa B (NF-kB) och värmechockproteiner (HSP-32: heme-oxygenas 1 (HO-1) och HSP- 70) har visat sig spela en roll vid vävnadsskydd. Utifrån denna kammare flik modell har två ändringar utvecklats i order att analysera kärlnybildning och mikrocirkulationen under huden graft healing 27 och angiogena utvecklingen i ett pedicled flik med axiell mönster perfusion 28. Vi presenterar en reproducerbar och pålitlig modell som inkluderar en ischemiskt utmanade musculocutaneous flik i musen skinfold kammaren. Denna modell möjliggör visualisering och kvantifiering av mikrocirkulationen och hemodynamiken genom intravital epi-fluorescensmikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att minska ischemiska komplikationer och därmed förbättra det kliniska resultatet, krävs bättre kunskaper om patofysiologiska processer i kritiskt perfusion klaffvävnad. Utvecklingen av nya djurmodeller som efterliknar akut ihållande ischemi är därför obligatorisk. Följaktligen kunde vi utveckla en lätt reproducerbar och pålitlig modell som gör det möjligt för upprepad morfologiska, dynamisk och funktionell realtid utvärdering av olika parametrar i muskler och hud kärl som kan korreleras med immun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Katharina Haber för bildredigering. Finansiering: senior författaren fick en KKF Grant från Technische Universität München för att inrätta ett nytt forskningslaboratorium.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
