שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em> במבחנה</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Red טיפול / אור האינפרה-אדום קרוב (R / NIR-LT), מועבר על ידי לייזר או אור דיודה (LED), משפר את התוצאות תפקודיות ומורפולוגיים במגוון של פציעות של מערכת עצבים מרכזיות בגוף חי, ככל הנראה על ידי הפחתת לחץ חמצוני. עם זאת, השפעות של R / NIR-LT על סטרס חמצונים הוכחו להשתנות בהתאם לאורך גל או עוצמת הקרינה. מחקרים שהשוו בין פרמטרים טיפול חסרים, בשל העדר מכשירים זמינים מסחרי המספקים אורכי גל מרובים או עוצמות, מתאימים לגבוהה דרך-לשים במחקרי אופטימיזציה מבחנה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה למסירה של אור בטווח של אורכי גל ועוצמות כדי לייעל את המינונים טיפוליים הנדרשים למודל פציעה נתון. חוקרים שערנו כי שיטה להעברת אור, שבו בקלות אפשר לשנות פרמטרים אורך גל ועוצמת, יכולה להקל על קביעת מינון אופטימלי של R / NIR-LT להפחתת מיני חמצן מגיבים(ROS) במבחנה.
אור קסנון ללא קוהרנטית היה מסונן דרך מסנני התערבות פס צר כדי לספק אורכי גל שונים (אורכי גל מרכז 440, 550, 670 ו810nm) וfluences (8.5 x 10 -3 ל -3.8 x 10 -1 J / 2 סנטימטר) של אור לתאים בתרבית. תפוקת אור מהמנגנון כוילה לפלוט מינונים רלוונטיים טיפולי, שווים quantal של אור בכל אורך גל. מינים תגובתי אותרו בגלוטמט הדגיש תאים שטופלו באור, באמצעות DCFH-DA וH 2 O 2 צבעי ניאון רגישים.
אנחנו בהצלחה נמסרו אור בטווח של אורכי גל רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית וטיפולי ועוצמות, לתאים בתרבית נחשפו לגלוטמט כמודל של פגיעה במערכת העצבים המרכזית. בעוד fluences של R / NIR-LT השתמש במחקר הנוכחי לא להפעיל השפעה על ROS שנוצר על ידי התאים בתרבית, השיטה של מסירת אור ישימה למערכות חלקות אחרותEMS לרבות מבודד מיטוכונדריה או יותר מבחינה פיזיולוגית מודלים תרבות הפרוסה organotypic רלוונטיות, ויכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות על מגוון של מדדי תוצאה של מטבוליזם חמצוני.
Introduction
מיני חמצן מגיבים (ROS) נדרשים למגוון רחב של מסלולי העברת אותות ותגובות נורמליות של חילוף חומרים תאיים, כוללים אלה של neuroprotection 1. עם זאת, כאשר המנגנון נוגד חמצון אנדוגני אינו מסוגלים לשלוט בייצור של ROS, תאים עשויים להיכנע ללחץ חמצוני 2,3. בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזי, העליות הקשורות בנוכחות של ROS וסטרס חמצונים הם חשבו לשחק תפקיד משמעותי בהתקדמות נזק 4,5. למרות המספר הרב של אסטרטגיות להחלשת לחץ חמצוני שכבר העריך, אין כיום, אסטרטגיות נוגדת חמצון רלוונטיים קליני יעילות לחלוטין להחלשת ייצור ROS וסטרס החמצונים הקשורים בשימוש קליני הבא neurotrauma 6. לכן הנחתה של סטרס חמצונים נשארה מטרה חשובה להתערבות טיפולית 7.
שיפורי מעקבR ing / NIR-LT כבר דיווח במגוון רחב של פציעות ומחלות, כולל הפחתה בגודל Cardial אוטם, סיבוכי כליות וכבדים בסוכרת, ניוון רשתית, פגיעה במערכת העצבים המרכזית ושבץ 8, אולי על ידי הפחתת לחץ חמצוני. בהתייחס בפרט לפגיעה במערכת העצבים המרכזית, מחקרים פרה-קליניים של יעילות של 670nm אור הראו השפעות טובות במודלים של ניוון רשתית 9-11, פגיעה בחוט השדרה 12, מוות עצבי 13. ניסויים קליניים שנערכו לגיל יבש הקשורים ניוון מקולרים והם מתנהלים כיום לשבץ 14, אולם התוצאות של ניסויים אלה אינם מופיעים מבטיחות, אולי בשל כשל להעסיק טיפול יעיל פרמטרים 15. ככזה, R / NIR-LT לא אומץ באופן נרחב כחלק מפרקטיקה קלינית רגילה בneurotrauma, למרות היותו קל לניהול, לא פולשנית וטיפול זול יחסית. חסמים לתרגום קליני כוללים חוסר CLמוקדם הבין מנגנון פעולה והיעדר 16,17 פרוטוקול טיפול יעיל סטנדרטי. ספרות הקיימת לגבי טיפול באור מגלה שפע של וריאציה בפרמטרי טיפול ביחס למקורות קרינה (LED או לייזר), גל (לדוגמא, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), מינון כולל (ג 'אול של קרינה / יחידת שטח), משך (זמן חשיפה), תזמון (עלבון מראש או שלאחר), תדירות טיפול ובמצב האספקה (דופק או מתמשך) 8. ההשתנות בפרמטרי טיפול בין המחקרים עושה השוואה קשה ותרמה לספקנות לגבי יעילות 16.
לכן, אופטימיזציה של R / NIR-LT בבירור נדרשת, עם מערכות תרבית תאים מסוגלים לספק את מנגנון הקרנת התפוקה הגבוהה הדרוש כדי להשוות את המשתנים המרובים. עם זאת יש מערכות תאורה זמינות מסחרי כמה שיכול לספק גמישות מספקת ושליטה על wavelength ועוצמה לבצע ניסויי אופטימיזציה כזה. מסחרי התקני LED זמינים הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק אורכי גל מרובים או עוצמות, וכתוצאה מכך חוקרי העסקת התקני LED מרובים של יצרנים שונים, אשר עשוי להשתנות לא רק בעצמה, אלא גם את הספקטרום של אורך גל של האור הנפלט. יש לנו לטפל בבעיה זו על ידי שימוש במקור אור בפס רחב קסנון המסונן דרך מסנני התערבות צר, ובכך לייצר מגוון רחב של אורכי גל וfluences של אור, המאפשר שליטה הדוקה, מדויקת של הפרמטרים של R / NIR-LT.
חשוב לציין כי המינון הטיפולי של טיפול מוגדר במספר הפוטונים אינטראקציה עם photoacceptor (chromophore), אשר, במקרה של R / NIR-LT הנחה היא להיות מונואמין ג ציטוכרום (COX) 18. אנרגיית פוטון נמסרה משתנה עם אורך גל; כלומר מינונים שווים של אנרגיה באורכי גל שונה יהיה comיקר של מספרים שונים של פוטונים. לכן, האור הנפלט מהמכשיר כויל לפלוט מספר שווה של פוטונים לכל אחד מאורכי הגל שנבחרו להיבדק. פיתחנו מערכת שיכול לשמש כדי לספק R / NIR-LT במגוון של אורכי גל ועוצמות לתאים במבחנה והפגנתי היכולת למדוד את ההשפעות של R מועבר / NIR-LT על ייצור ROS בתאים נתון ל לחץ גלוטמט.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו להתאים בהצלחה מערכת אספקת האור מדויקת ומכוילת לספק מנגנון למחקר של אופטימיזציה של R / NIR-LT במבחנה. פרמטרים אורך גל ועוצמת R / NIR-LT מסוגלים לטפל בצורה מדויקת ויעיל באמצעות מערכת זו. אנחנו קבענו כי טיפול באור של התאים לא הובילו למוות של תאים, אם כי ROS לא הוקטן באו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
