Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em> İn Vitro</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Lazer veya ışık yayan diyot (LED) tarafından teslim Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık tedavisi (R / NIR-LT), muhtemelen oksidatif stresi azaltarak in vivo merkezi sinir sistemi yaralanmaları, bir dizi fonksiyonel ve morfolojik sonuçlar geliştirir. Bununla birlikte, oksidatif stres R / NIR LT etkileri dalga boyu ya da ışının yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir gösterilmiştir. Tedavi parametreleri karşılaştıran çalışmalar nedeniyle vitro optimizasyon çalışmalarında koymak yoluyla yüksek uygun çoklu dalga boylarını veya yoğunluklarını, teslim piyasada mevcut cihazların olmaması nedeniyle, eksiktir. Bu protokol belirli bir yaralanma modeli için gerekli olan terapötik dozları optimize etmek için dalga boyu ve yoğunluk aralığında ışık iletimi için bir yöntem açıklanır. Bu dalga boyu ve yoğunluk parametreleri kolayca değiştirilebilir hangi ışık sağlamaya yarayan bir yöntem olup, reaktif oksijen türleri azaltmak için Ar / NIR LT optimal dozunun belirlenmesini kolaylaştırmak ileri sürdülerIn vitro (ROS).
Düzensiz Xenon lambası değişen dalga boylarında (440, 550, 670 merkezi dalga boylarının ve 810nm) ve akızamanları sağlamak için dar bantlı girişim filtreleri içinden süzülmüş (8.5 x 10 -3 3.8 x 10 -1 J / cm2) ışık kültür hücreleri. Aygıtından Işık çıkışı, her dalga boyunda ışık, terapötik anlamda ilgili, eşit quantal doz yayılmasını sağlamak için kalibre edilmiştir. Glutamat DCFH-DA ve H2O 2 duyarlı fluoresan boyalar kullanılarak ışık ile muamele edilmiş hücreler stresli reaktif türleri tespit edilmiştir.
Başarıyla MSS yaralanması modeli olarak glutamata maruz kültür hücreleri, ilgili dalga boylarında ve yoğunlukları, fizyolojik ve terapötik bir aralığında ışık vermiştir. Kültürlenmiş hücreler tarafından üretilen ROS üzerinde bir etki gösterebilir değil mevcut çalışmada kullanılan R / NIR LT akıcılıklarda birlikte, ışık uygulama yöntemi için diğer syst için geçerlidirems daha fizyolojik mitokondri veya ilgili organotipik dilim kültür modelleri izole dahil, ve oksidatif metabolizma sonucu önlemlerinin bir dizi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS) sinyal transdüksiyon yollar ve nöro-1 de dahil olmak üzere, hücresel metabolizmanın normal reaksiyonlar, bir dizi gereklidir. Endojen antioksidan mekanizma ROS üretimini kontrol edemiyoruz Ancak, hücreler oksidatif strese 2,3 yenik düşebilir. MSS yaralanma sonrasında, ROS ve oksidatif stres varlığında ilişkili artışlar hasar 4,5 ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Değerlendirilmiştir oksidatif stres zayıflatmaya yönelik stratejiler geniş olmasına rağmen, nörotravma 6 aşağıdaki klinik kullanımda ROS üretimini ve ilişkili oksidatif stresi zayıflatmaya yönelik hiçbir tamamen etkili, klinik açıdan önemli bir anti-oksidan stratejileri şu anda. Bu nedenle oksidatif stres zayıflama terapötik müdahale 7 için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.
İyileştirmeler takiping R / NIR LT yaralanmalar ve belki de oksidatif stres azaltarak miyokard enfarktüs boyutu, diyabet renal ve hepatik komplikasyonlar, retinal dejenerasyon, merkezi sinir sistemi hasarı ve inme 8 azalmalar da dahil olmak üzere geniş bir hastalık aralığında bildirilmiştir. MSS yaralanması, özellikle ilgili olarak, 670nm ışık etkinliğinin klinik öncesi çalışmalar, retinal dejenerasyon 9-11, omurilik yaralanması, 12 nöronal ölüm 13 modellerinde iyi etki gözlemlenmemiştir. Klinik çalışmalar, ancak bu çalışmaların sonuçları 15 parametreleri etkin tedavi istihdam belki de bir arıza, umut verici görünmüyor, bağlı makula dejeneresansı kuru yaş için yapılan ve inme 14 şu anda devam etmektedir edilmiştir. Gibi, R / NIR-LT yaygın bir non-invaziv, yönetmek kolay ve nispeten ucuz bir tedavi olmasına rağmen, nörotravmada normal klinik pratikte bir parçası olarak kabul edilmemiştir. Klinik çeviri Engeller bir cl eksikliği,Erken bir standart etkili tedavi protokolü 16,17 eylem ve yokluğu mekanizmasını anladım. Işık tedavisi ile ilgili güncel literatür ışınlama kaynaklarına göre (LED veya lazer), dalga boyu (örneğin, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), ışınlama toplam dozu (joule / tedavi parametrelerinin varyasyon bir bolluk ortaya birim alan), süresi (maruz kalma süresi), zamanlama (öncesi veya sonrası hakaret), tedavi sıklığı ve doğum şekli () darbeli veya sürekli 8. çalışmalar arasında tedavi parametreleri değişkenlik karşılaştırma zorlaştırır ve etkinliği 16 ilişkin şüphecilik katkıda bulunmuştur.
Bu nedenle, R / NIR-LT optimizasyonu açıkça birden değişkenleri karşılaştırmak için gerekli yüksek verimli tarama mekanizması sağlamak mümkün hücre kültürü sistemleri, gereklidir. Ancak wa üzerinde yeterli esneklik ve kontrol sağlayabilir birkaç piyasada mevcut aydınlatma sistemleri vardırvelength ve yoğunluğu gibi optimizasyon deneyleri gerçekleştirmek için. Ticari olarak temin edilebilen cihazlar genel olarak ışık yoğunluğu, sadece farklı olabilir, farklı üreticiler tarafından birden çok LED elemanları içeren araştırmacılar olarak elde edilen çoklu dalga ya da yoğunlukları, teslim etmek mümkün değil, aynı zamanda yayılan ışığın dalga boyu spektrumu değildir. Biz böylece R / NIR-LT parametrelerinin yakın, doğru kontrol sağlayan, dalga boyu ve ışık akıcılıklarda bir dizi üreten, dar girişim filtreleri ile filtre geniş bant Xenon ışık kaynağı kullanılarak bu konuya değindik.
Bu tedavinin terapötik doz R / NIR LT durumunda sitokrom C oksidaz (COX) 18 olduğu kabul edilmektedir, photoacceptor (kromofor) ile etkileşim fotonların sayısı ile tanımlanır dikkat etmek önemlidir. Teslim foton enerjisi dalga boyu ile değişir; farklı dalga boylarında enerji eşit dozlarda anlam com olacakfotonların farklı sayılar ödüllü. Bu nedenle, cihazdan çıkan ışık, test edilecek seçilmiş dalga boylarının her biri için bir foton eşit sayıda yaymak üzere kalibre edilmiştir. Biz in vitro hücrelere dalga boyu ve yoğunlukları aralığında R / NIR-LT sunmak için kullanılabilecek bir sistem geliştirildi ve tabi hücrelerde ROS üretimi üzerinde teslim R / NIR-LT etkilerini ölçmek yeteneği göstermiştir glutamat stres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz başarıyla R / NIR-LT in vitro optimizasyonu çalışması için bir mekanizma sağlamak için kesin ve kalibre ışık iletim sistemini adapte var. R Dalgaboyu ve yoğunluk parametreleri / NUR-LT, bu sistemi kullanarak doğru ve etkili bir şekilde manipüle edilmesi mümkün bulunmaktadır. ROS test edilen hücre tiplerinde, Verilen dalga boylarında ve dozajlarda düşük değil, ancak biz, hücre ölümüne yol açmamıştır hücrelerininkine ışık tedavisi kurulmuştur. 670nm (20.11W / m 2)</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
