Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em> In Vitro</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
/ Terapia Red de infrarrojo cercano luz (R / NIR-LT), entregado por láser o diodo emisor de luz (LED), mejora los resultados funcionales y morfológicos en una gama de lesiones del sistema nervioso central in vivo, posiblemente mediante la reducción del estrés oxidativo. Sin embargo, se han mostrado efectos de R / NIR-LT sobre el estrés oxidativo a variar dependiendo de la longitud de onda o la intensidad de la irradiación. Los estudios que compararon los parámetros de tratamiento se carece, debido a la ausencia de dispositivos disponibles en el mercado que ofrecen múltiples longitudes de onda o intensidades, apto para alta rendimiento de procesamiento en los estudios de optimización vitro. Este protocolo describe una técnica para la entrega de la luz en una gama de longitudes de onda e intensidades para optimizar las dosis terapéuticas requeridas para un modelo de lesión dado. La hipótesis de que un método de entrega de la luz, en el que los parámetros de longitud de onda e intensidad podría modificarse fácilmente, podría facilitar la determinación de una dosis óptima de R / NIR-LT para la reducción de especies reactivas de oxígeno(ROS) in vitro.
Luz no coherente Xenon se filtró a través de filtros de interferencia de banda estrecha para proporcionar longitudes de onda diferentes (longitudes de onda centrales de 440, 550, 670 y 810 nm) y flujos de energía (8,5 x 10 -3 a 3,8 x 10 -1 J / cm 2) de la luz a las células cultivadas. La salida de luz del aparato se calibró para emitir dosis cuantales terapéuticamente relevantes, iguales de luz en cada longitud de onda. Se detectaron especies reactivas en glutamato destacó las células tratadas con la luz, utilizando DCFH-DA y H 2 O 2 tintes fluorescentes sensibles.
Nos éxito librados luz en una gama de longitudes de onda fisiológica y terapéuticamente e intensidades pertinentes, a las células cultivadas expuestas a glutamato como un modelo de lesión del SNC. Mientras que las fluencias de R / NIR-LT utilizados en el estudio actual no ejercer un efecto sobre ROS generado por las células cultivadas, el método de suministro de luz es aplicable a otros Systems incluyendo mitocondrias o más fisiológicamente modelos de cultivo rebanada organotípicos pertinentes aislado, y podría utilizarse para evaluar los efectos sobre una serie de medidas de resultado del metabolismo oxidativo.
Introduction
Se requieren especies reactivas de oxígeno (ROS) para una serie de vías de transducción de señales y reacciones normales del metabolismo celular, incluidos los de neuroprotección 1. Sin embargo, cuando el mecanismo antioxidante endógeno no son capaces de controlar la producción de ROS, las células pueden sucumbir a estrés oxidativo 2,3. Después de una lesión en el SNC, se cree que los aumentos asociados en la presencia de ROS y el estrés oxidativo a desempeñar un papel importante en la progresión del daño 4,5. A pesar de la extensa serie de estrategias para atenuar el estrés oxidativo que se han evaluado, actualmente no existen estrategias de anti-oxidantes completamente eficaces, clínicamente relevantes para la atenuación de la producción de ROS y el estrés oxidativo asociado en uso clínico siguiente neurotrauma 6. Por lo tanto la atenuación del estrés oxidativo sigue siendo un objetivo importante para la intervención terapéutica 7.
Mejoras siguening R / NIR-LT se han reportado en una amplia gama de lesiones y enfermedades, incluyendo reducciones en el tamaño del infarto de miocardio, las complicaciones renales y hepáticas durante diabetes, degeneración de la retina, la lesión del SNC y accidente cerebrovascular 8, quizás al reducir el estrés oxidativo. Con especial atención a la lesión del SNC, los estudios preclínicos de eficacia de la luz 670 nm han demostrado buenos efectos en los modelos de degeneración retiniana 9-11, lesión de la médula espinal 12, la muerte neuronal 13. Se han llevado a cabo ensayos clínicos para la edad seco degeneración macular relacionada y están actualmente en curso para el accidente cerebrovascular 14, sin embargo los resultados de estos ensayos no parecen prometedores, quizás debido a la imposibilidad de emplear un tratamiento efectivo parámetros 15. Como tal, R / NIR-LT no ha sido ampliamente adoptado como parte de la práctica clínica normal en neurotrauma, a pesar de ser una fácil de administrar, no invasiva y tratamiento relativamente barato. Las barreras a la traducción clínica incluyen la falta de un cltemprano entendido mecanismo de acción y la ausencia de un protocolo de tratamiento efectivo 16,17 estandarizado. La literatura actual con respecto a la terapia de luz revela una gran cantidad de variación en los parámetros de tratamiento con respecto a las fuentes de irradiación (LED o láser), longitud de onda (por ejemplo, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), la dosis total (julios de irradiación / unidad de superficie), la duración (tiempo de exposición), el tiempo (insulto previo o posterior), la frecuencia del tratamiento y el tipo de parto (pulso o continua) 8. La variabilidad en los parámetros de tratamiento entre los estudios dificulta la comparación y ha contribuido al escepticismo respecto a la eficacia 16.
Por lo tanto, la optimización de R / NIR-LT está claramente necesario, con los sistemas de cultivo de células capaces de proporcionar el mecanismo de selección de alto rendimiento necesario comparar las múltiples variables. Sin embargo, hay pocos sistemas de iluminación disponibles en el mercado que pueden proporcionar la flexibilidad y el control suficiente sobre wavelength e intensidad para realizar este tipo de experimentos de optimización. Comercialmente dispositivos LED disponibles son generalmente no capaz de entregar múltiples longitudes de onda o intensidades, resultando en investigadores que emplean múltiples dispositivos LED de diferentes fabricantes, que pueden variar no sólo en la intensidad, sino también el espectro de longitud de onda de la luz emitida. Hemos abordado este problema mediante el empleo de una banda ancha de xenón fuente de luz filtrada a través de filtros de interferencia de banda estrecha, generando de ese modo una gama de longitudes de onda y fluencias de luz, lo que permite un estrecho control y precisa de los parámetros de R / NIR-LT.
Es importante señalar que la dosis terapéutica de tratamiento se define por el número de fotones que interactúan con el photoacceptor (cromóforo), que, en el caso de R / NIR-LT se postula que el citocromo c oxidasa (COX) 18. La energía fotónica entregado varía con la longitud de onda; es decir, dosis iguales de energía a diferentes longitudes de onda será compreciada de diferentes números de fotones. Por lo tanto, la luz emitida desde el dispositivo fue calibrado para emitir un número igual de fotones para cada una de las longitudes de onda elegidas para ser probado. Hemos desarrollado un sistema que puede ser utilizado para entregar R / NIR-LT en un rango de longitudes de onda e intensidades a las células in vitro y ha demostrado la capacidad de medir los efectos de la entrega R / NIR-LT sobre la producción de ROS en células sometidas a estrés glutamato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos adaptado con éxito un sistema de suministro de luz precisa y calibrado para proporcionar un mecanismo para el estudio de optimización de R / NIR-LT in vitro. Longitud de onda y la intensidad de los parámetros de R / NIR-LT son capaces de ser manipulado con precisión y eficacia el uso de este sistema. Hemos establecido que el tratamiento de luz de las células no dio lugar a la muerte celular, aunque ROS no se reduce a las longitudes de onda y las dosis entregadas, de los tipos celulares de la prueba. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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