Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em> In Vitro</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Red / terapia della luce nel vicino infrarosso (R / NIR-LT), consegnato da laser o diodi emettitori di luce (LED), migliora i risultati funzionali e morfologiche a una serie di lesioni del sistema nervoso centrale in vivo, possibilmente riducendo lo stress ossidativo. Tuttavia, gli effetti di R / NIR-LT sullo stress ossidativo hanno dimostrato di variare a seconda lunghezza d'onda o intensità di irraggiamento. Gli studi che confrontano parametri di trattamento mancano, a causa della mancanza di dispositivi disponibili in commercio in grado di offrire di più lunghezze d'onda o intensità, adatti per alta through-put in studi di ottimizzazione in vitro. Questo protocollo descrive una tecnica per la consegna di luce in un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di ottimizzare dosi terapeutiche richieste per un determinato modello di lesione. Abbiamo ipotizzato che un metodo di fornire luce, in cui i parametri di lunghezza d'onda e intensità potrebbero facilmente essere alterati, potrebbe facilitare la determinazione di una dose ottimale di R / NIR-LT per ridurre le specie reattive dell'ossigeno(ROS) in vitro.
Non coerente Xenon è stata filtrata attraverso filtri interferenziali a banda stretta per offrire lunghezze d'onda diverse lunghezze d'onda (centro di 440, 550, 670 e 810 nm) e fluenze (8,5 x 10 -3 a 3,8 x 10 -1 J / cm 2) della luce a cellule in coltura. L'emissione luminosa dall'apparato è stato calibrato per emettere terapeuticamente rilevanti, dosi uguali quantali di luce ad ogni lunghezza d'onda. Specie reattive sono state rilevate in glutammato sottolineato cellule trattate con la luce, utilizzando DCFH-DA e H 2 O 2 coloranti fluorescenti sensibili.
Abbiamo consegnato con successo luce in una gamma di lunghezze d'onda fisiologicamente e terapeuticamente e intensità rilevanti, a cellule in coltura esposte a glutammato come modello di lesioni del sistema nervoso centrale. Mentre le influenze di R / NIR-LT utilizzati in questo studio non esercitare un effetto sulla ROS generato dalle cellule in coltura, il metodo di consegna luce è applicabile ad altri systems compresi mitocondri o più fisiologicamente rilevanti modelli cultura fetta organotipiche isolate, e potrebbe essere utilizzato per valutare gli effetti su una serie di misure di outcome del metabolismo ossidativo.
Introduction
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono necessari per una serie di trasduzione del segnale e le normali reazioni del metabolismo cellulare, inclusi quelli di neuroprotezione 1. Tuttavia, quando il meccanismo endogeno antiossidante sono in grado di controllare la produzione di ROS, le cellule possono soccombere allo stress ossidativo 2,3. Dopo lesioni al sistema nervoso centrale, gli aumenti legati in presenza di ROS e lo stress ossidativo sono pensati per svolgere un ruolo importante nella progressione del danno 4,5. Nonostante l'ampio numero di strategie per attenuare lo stress ossidativo che sono stati valutati, non vi sono attualmente completamente efficaci, le strategie antiossidanti clinicamente rilevanti per attenuare la produzione di ROS e lo stress ossidativo associato in uso clinico dopo neurotrauma 6. Pertanto, l'attenuazione dello stress ossidativo resta un obiettivo importante per l'intervento terapeutico 7.
Miglioramenti seguonoR ing / NIR-LT sono stati riportati in una vasta gamma di lesioni e malattie, tra cui la riduzione delle dimensioni dell'infarto miocardico, le complicanze renali ed epatiche durante il diabete, degenerazione della retina, lesioni del sistema nervoso centrale e ictus 8, forse riducendo lo stress ossidativo. Con particolare riguardo alla lesione del sistema nervoso centrale, studi preclinici di efficacia della luce 670nm hanno mostrato effetti positivi in modelli di degenerazione retinica 9-11, lesioni del midollo spinale 12, morte neuronale 13. Sono stati condotti studi clinici per l'età a secco degenerazione maculare e sono attualmente in corso per l'ictus 14, ma i risultati di questi studi non appaiono promettenti, forse a causa di un errore di impiegare un trattamento efficace parametri 15. Come tale, R / NIR-LT non è stato ampiamente adottato come parte della pratica clinica normale neurotrauma, pur essendo facile da amministrare, non invasivo e trattamento relativamente poco costoso. Ostacoli alla traduzione clinica includono la mancanza di un clmeccanismo di azione e l'assenza di un protocollo standardizzato efficace 16,17 trattamento precoce compreso. Letteratura attuale per quanto riguarda la terapia della luce rivela una pletora di variazione di parametri di trattamento per quanto riguarda le fonti di irradiazione (LED o laser), la lunghezza d'onda (ad esempio, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), dosi totali (joule di irraggiamento / unità di superficie), la durata (tempo di esposizione), tempistica (insulto pre- o post), la frequenza del trattamento e modalità di consegna (impulso o continua) 8. La variabilità dei parametri di trattamento tra gli studi rende difficile il confronto e ha contribuito allo scetticismo per quanto riguarda l'efficacia 16.
Pertanto, l'ottimizzazione della R / NIR-LT è chiaramente necessario, con sistemi di coltura di cellule in grado di fornire il meccanismo di screening high-throughput necessario per confrontare le molteplici variabili. Tuttavia ci sono alcuni sistemi di illuminazione disponibili in commercio in grado di fornire la flessibilità e il controllo sufficiente sulle wavelength e l'intensità di effettuare tali esperimenti di ottimizzazione. Commercialmente dispositivi disponibili LED sono generalmente in grado di fornire più lunghezze d'onda o intensità, con conseguente investigatori impiegano più dispositivi LED di diversi produttori, che possono variare non solo in intensità, ma anche lo spettro di lunghezza d'onda della luce emessa. Abbiamo affrontato questo problema utilizzando una sorgente di luce a banda larga Xenon filtrata attraverso filtri di interferenza a banda stretta, generando così una gamma di lunghezze d'onda e fluenze di luce, consentendo chiudere, accurato controllo dei parametri di R / NIR-LT.
È importante notare che la dose terapeutica del trattamento è definito dal numero di fotoni che interagiscono con il photoacceptor (cromoforo), che, nel caso di R / NIR-LT è postulata essere citocromo c ossidasi (COX) 18. Energia Photon erogata varia con lunghezza d'onda; significato uguali dosi di energia a diverse lunghezze d'onda sarà compregiato diverso numero di fotoni. Pertanto, la luce emessa dal dispositivo è stato calibrato per emettere un numero uguale di fotoni per ognuna delle lunghezze d'onda scelte da testare. Abbiamo sviluppato un sistema che può essere utilizzato per fornire R / NIR-LT in un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di cellule in vitro e dimostrato la capacità di misurare gli effetti del trasporto di R / NIR-LT sulla produzione di ROS in cellule sottoposte a lo stress glutammato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo adattato con successo un sistema di erogazione precisa della luce e tarato per fornire un meccanismo per lo studio di ottimizzazione di R / NIR-LT in vitro. Lunghezza d'onda e intensità di parametri R / NIR-LT sono in grado di essere manipolato accuratamente ed efficacemente usando questo sistema. Abbiamo stabilito che la luce il trattamento delle cellule non ha portato alla morte delle cellule, anche se ROS non sono stati ridotti alle lunghezze d'onda e dosaggi consegnati, nei tipi cellulari t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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