Метод оценки воздействия диапазоне длин волн и интенсивностей красный / ближней инфракрасной световой терапии на окислительного стресса<em> In Vitro</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Красный / около инфракрасный свет терапия (R / NIR-LT), с которым выступил лазерном или светоизлучающий диод (LED), улучшает функциональные и морфологические результаты в диапазоне центральная система повреждений нервной в естественных условиях, возможно, за счет снижения окислительного стресса. Тем не менее, влияние R / NIR-LT на окислительный стресс, как было показано варьироваться в зависимости от длины волны и интенсивности облучения. Исследования, сравнивающие параметры лечения не хватает, из-за отсутствия коммерчески доступных устройств, которые обеспечивают несколько длин волн или интенсивности, подходящие для высокой пропускной положить в пробирке исследования оптимизации. Этот протокол описан способ доставки света в диапазоне длин волн и интенсивности для оптимизации терапевтических доз, необходимых для данной модели травмы. Мы предположили, что метод доставки света, в которых могут быть легко изменены длины волны и интенсивности параметры, может облегчить определение оптимального дозы R / NIR-LT для снижения реактивных форм кислорода(ROS) в пробирке.
Некогерентное ксеноновые фары фильтруют через узкополосных интерференционных фильтров, чтобы доставить различные длины волн (в центре длины волн 440, 550, 670 и 810nm) и флюенсы (8,5 × 10 -3 до 3,8 × 10 -1 Дж / см 2) света в культивируемых клетках. Светоотдача из устройства калибруют, чтобы излучать соответствующие терапевтически, равные квантовых дозы света на каждой длине волны. Активные формы были обнаружены в глутамат подчеркнул клетки, обработанные с учетом, используя DCFH-DA и H 2 O 2 чувствительных флуоресцентных красителей.
Мы успешно доставлено свет в диапазоне физиологически и терапевтически соответствующих длин волн и интенсивностей, в культивируемых клетках, подвергшихся воздействию глутамата в качестве модели повреждения ЦНС. В то время как флюенсами R / NIR-LT, используемых в данном исследовании не оказывают влияния на ROS, генерируемого культивируемых клеток, способ доставки света применимо к другим систEMS включая изолированные митохондрии или более физиологически соответствующие органотипической модели ломтик культура, и может быть использован для оценки воздействия на целый ряд критериев исхода окислительного метаболизма.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) требуется для ряда сигнальных путей трансдукции и нормальных реакций клеточного метаболизма, в том числе нейропротекции 1. Однако, когда эндогенный антиоксидант механизм не в состоянии контролировать производство АФК, клетки могут поддаваться окислительным стрессом 2,3. После травмы ЦНС, что приводит к повышению в присутствии АФК и окислительного стресса, как полагают, играют существенную роль в прогрессировании повреждения 4,5. Несмотря на широкое ряда стратегий для ослабления окислительного стресса, которые были оценены, не существует в настоящее время нет полностью эффективных, клинически значимые стратегии антиоксидантные для ослабления АФК и связанного с окислительного стресса в клинической практике следующие нейротравме 6. Поэтому ослабление окислительного стресса остается важной целью для терапевтического вмешательства 7.
Улучшения следоватьчисле R / NIR-LT были зарегистрированы в широком диапазоне повреждений и заболеваний, включая сокращение размера инфаркта сердечной, почечной и печеночной осложнений во время диабета, дегенерации сетчатки, травмы ЦНС и инсульта 8, возможно, снижая окислительный стресс. Что касается непосредственно повреждения ЦНС, доклинические исследования эффективности 670 нм света показали хорошие эффекты в моделях дегенерации сетчатки 9-11, повреждение спинного мозга 12, гибели нейронов 13. Клинические испытания были проведены для сухой возрастной макулярной дегенерации и в настоящее время инсульта 14, однако результаты этих исследований не выглядят многообещающими, возможно, из-за сбоя использовать эффективное лечение параметров 15. Таким образом, R / NIR-LT не были широко приняты как часть обычной клинической практике в нейротравме, несмотря на то, легка в управлении, неинвазивный и относительно недорогое лечение. Барьеры на пути к клинической перевода включают в себя отсутствие в клраннего понимать механизм действия и отсутствие стандартизованной эффективного 16,17 протокол лечения. Текущий литература о световой терапии показывает множество вариаций в параметрах лечения по отношению к источникам облучения (LED или лазером), длины волны (например, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), общая доза (Дж облучения / на единицу площади), продолжительность (время экспозиции), сроки (до или после оскорблять), частота лечения и способ родоразрешения (импульсный или непрерывный) 8. Изменчивость параметров обработки между исследованиями делает сравнение трудным и внесла свой вклад в скептицизм в отношении эффективности 16.
Таким образом, оптимизация R / NIR-LT Очевидно, что необходимо, с систем клеточных культур, способных обеспечивать механизм высокопроизводительного скрининга необходимо сравнить несколько переменных. Однако есть несколько коммерчески доступных осветительные системы, которые могут обеспечить достаточную гибкость и контроль над ваvelength и интенсивность выполнять такие эксперименты по оптимизации. Коммерчески доступные устройства СИД, как правило, не способны доставить несколько длин волн или интенсивности, в результате чего исследователей, использующих несколько светодиодных устройств от разных производителей, которые могут меняться не только в интенсивности, но и спектр волны излучаемого света. Мы решили эту проблему путем использования широкополосного ксеноновые источник света фильтруют через узкополосный интерференционных фильтров, тем самым создавая диапазоне длин волн и флюенсах света, что позволяет близко, точный контроль параметров R / NIR-LT.
Важно отметить, что терапевтическая доза лечения определяется число фотонов, взаимодействующих с photoacceptor (хромофора), который, в случае R / NIR-LT является предполагаемым быть цитохром с оксидазы (COX) 18. Энергия фотона доставлен изменяется с длиной волны; это означает, равные дозы энергии на различных длинах волн будет комценится из различного числа фотонов. Таким образом, свет, испускаемый из устройства калибруют, чтобы излучать одинаковое количество фотонов для каждого из выбранных длин волн для тестирования. Мы разработали систему, которая может быть использована для доставки R / NIR-LT в диапазоне длин волн и интенсивностей в клетки в пробирке и продемонстрировал способность измерять воздействие при поставке R / NIR-LT на продукции АФК в клетках, подвергнутых глутамат стресс.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы успешно приспособлены точное и калиброванного системы доставки света, чтобы обеспечить механизм для изучения оптимизации R / NIR-LT в пробирке. Длина волны и интенсивность параметры R / NIR-LT могут манипулировать точно и эффективно использовать эту систему. Мы установили, что светол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
