酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em>インビトロ</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
レーザーまたは発光ダイオード（LED）によって送達赤/近赤外光療法（R / NIR-LT）は、おそらく酸化ストレスを減少させることによって、in vivoでの中枢神経系損傷の範囲内の機能的および形態学的転帰を改善する。しかし、酸化的ストレスに対するR / NIR-LTの効果は波長や照射強度に応じて変化することが示されている。治療パラメータを比較した研究は、スループットインビトロ最適化研究において高適し複数の波長または強度を提供し、商業的に入手可能なデバイスが存在しないこと、に起因する欠けている。このプロトコルは、与えられた損傷モデルに必要な治療用量を最適化するための波長および強度の範囲で光を送達するための技術が記載されている。我々は、波長および強度のパラメータを容易に変更することができた光を送達する方法は、活性酸素種を減少させるためのR / NIR-LTの最適用量の決定を容易にすることができるという仮説を立てin vitroで（ROS）。
非コヒーレントキセノン光は、光の各波長（440、550、670及び810nmの中心波長）とフルエンス（8.5×10 -3 -1×10 3.8 J / cm 2程度） を送達するために狭帯域干渉フィルターを通して濾過し培養細胞へ。装置から出力された光は、各波長の光の治療に関連する、同じ量子的用量を放出するように較正した。グルタミン酸は、DCFH-DAとH 2 O 2感受性蛍光色素を使用して、光で処理した細胞を強調に反応種が検出された。
我々は成功し、CNS損傷のモデルとしてグルタミン酸に曝露された培養細胞に、生理的におよび治療に関連する波長および強度の範囲で光を配信。現在の研究で使用したR / NIR-LTのフルエンスは、培養細胞によって生成されたROSに影響を及ぼさなかったが、光送達の方法は、他のシステム経験にも適用可能であるemsのは、単離されたミトコンドリアまたはそれ以上の生理学的に関連する器官型スライス培養モデルを含む、酸化的代謝のアウトカム指標の範囲への影響を評価するために使用することができる。
Introduction
活性酸素種（ROS）は、シグナル伝達経路および神経保護1のものを含む細胞代謝の正常な反応の範囲のために必要とされる。内因性の抗酸化機構がROSの産生を制御することができないしかし、細胞が酸化ストレス2,3に屈することができる。 CNSへの傷害後、ROS及び酸化ストレスの存在下での関連する増加は、損傷4,5の進行において重要な役割を果たしていると考えられている。評価されている酸化ストレスを減衰させるための戦略の大規模な数にもかかわらず、神経外傷6以下の臨床使用においてROS産生と関連した酸化ストレスを減衰させるには完全に有効な、臨床的に関連する抗酸化戦略は現在のところ存在しない。そのため酸化ストレスの減衰が治療的介入7のための重要な目標である。
改善が続くるR / NIR-LTは、傷害、おそらく酸化ストレスを減少させることによって噴門梗塞サイズ、糖尿病時の腎臓および肝臓の合併症、網膜変性、CNS損傷および脳卒中8の減少を含む、広範囲の疾患において報告されている。 CNS損傷に特に関連して、670nmの光の効果の前臨床試験は、網膜変性9-11、脊髄損傷12、ニューロン死13のモデルにおいて良好な効果を示した。臨床試験は、乾燥加齢黄斑変性症のために実施し、ストローク14のために、現在進行中でされてきた、しかし、これらの試験の結果はおそらく効果的な治療パラメータ15を採用する障害のため、有望な表示されません。このように、R / NIR-LTが広く、管理が容易な、非侵襲的で比較的安価な治療にもかかわらず、神経外傷の通常の臨床診療の一部として採用されていない。臨床翻訳への障壁は、CLの欠如、早期の標準化された効果的な治療プロトコル16,17の作用と不在の仕組みを理解していた。現在の光療法に関する文献は、照射源（LEDやレーザ）に対する治療パラメータの変動の過多を明らかにし、照射の波長（ 例えば 、630、670、780、810、830、880、904nm）、総投与量（ジュール/単位面積）、持続時間（露光時間）、タイミング（前または後の傷害）、配信の治療頻度及びモード（パルスまたは連続）8。研究間の治療パラメータの変動は、比較を困難にし、有効性16に関して懐疑的な見方に貢献してきました。
従って、R / NIR-LTの最適化が明らかに複数の変数を比較するために必要なハイスループットスクリーニング機構を提供することができる細胞培養系で、必要とされる。しかしWA上に十分な柔軟性と制御を提供することができ、いくつかの市販の照明システムがあるvelengthおよび強度は、このような最適化実験を行う。市販のLEDデバイスは、一般に、強度だけではなく変化し得る異なるメーカーからの複数のLED素子を用いた研究者らは、その結果、複数の波長または強度を、提供することができ、また、発光波長のスペクトルではない。我々は、狭帯域干渉フィルターを通して濾過し、広帯域キセノン光源を用いて光の波長およびフルエンスの範囲を生成し、R / NIR-LTのパラメータの近くに、正確な制御を可能にすることによって、この問題に対処している。
これは、処置の治療用量は、R / NIR-LTの場合、シトクロムcオキシダーゼ （COX）18であると仮定され、photoacceptor（発色団）と相互作用する光子の数によって定義されることに留意することが重要である。配信光子エネルギーは、波長に応じて変化する。異なる波長におけるエネルギーの等しい用量を意味するであろうコム光子の異なる数の珍重。したがって、装置から出射された光は、試験されるべき選択された波長の各々についての光子の数と同じ数を放出するように較正した。我々は、in vitroでの細胞への波長および強度の範囲でR / NIR-LTを送達するために用いることができるシステムを開発したが施さ細胞におけるROS産生に対する配信R / NIR-LTの効果を測定する能力を実証しているグルタミン酸ストレス。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々が正常にR / NIR-LT インビトロの最適化の研究のためのメカニズムを提供するための正確かつ較正された送達システムを適応している。 R / NIR-LTの波長および強度のパラメータは、このシステムを使用して、正確かつ効率的に操作されることが可能である。我々は、ROSは、試験した細胞型において、送達波長および用量で減少しなかったが、細胞の光治療は、細胞死をもたらさなかっ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
