Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em> In-vitro-</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Rot / Nahinfrarotlicht Therapie (R / NIR-LT) durch Laser- oder Leuchtdiode (LED) geliefert werden, verbessert funktionellen und morphologischen Ergebnisse in einem Bereich des zentralen Nervensystems Verletzungen in vivo, ggf. durch Reduzierung von oxidativem Stress. Jedoch Wirkungen von R / NIR-LT auf oxidativen Stress wurde gezeigt abhängig von der Wellenlänge oder der Intensität der Bestrahlung ab. Studien zum Vergleich der Behandlungsparameter fehlen, aufgrund der Abwesenheit von im Handel erhältlichen Geräten, die mehrere Wellenlängen und Intensitäten, geeignet für Hochdurchsatz-in-vitro-Optimierungsstudien liefern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Abgabe von Licht in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten der therapeutischen Dosis für eine gegebene Verletzungsmodell erforderlich optimieren. Wir nahmen an, dass eine Methode der Bereitstellung von Licht, in dem Wellenlängen- und Intensitätsparameter könnte leicht geändert werden könnten Bestimmung einer optimalen Dosis von R / NIR-LT zur Reduzierung reaktiver Sauerstoffspezies zu erleichtern(ROS) in vitro.
Nichtkohärenten Xenon-Licht wurde mit Schmalband-Interferenz-Filter filtriert, um unterschiedlicher Wellenlänge (Mittenwellenlängen von 440, 550, 670 und 810 nm) und Fluenzen liefern (8,5 x 10 -3 bis 3,8 x 10 -1 J / cm 2) der Licht auf kultivierte Zellen. Lichtausbeute aus der Vorrichtung wurde kalibriert, um therapeutisch relevante, gleich Quanten Dosen von Licht bei jeder Wellenlänge emittieren. Reaktive Spezies nachgewiesen in Glutamat gestreßten Zellen mit Licht behandelt, mit DCFH-DA und H 2 O 2 sensitive Fluoreszenzfarbstoffe.
Wir haben erfolgreich geliefert Licht bei einer Reihe von physiologisch und therapeutisch relevanten Wellenlängen und Intensitäten, um kultivierte Zellen zu Glutamat als Modell der ZNS-Verletzung ausgesetzt. Während die Einflüsse von R / NIR-LT in der vorliegenden Studie verwendet nicht eine Wirkung auf ROS durch die kultivierten Zellen erzeugten ausübt, ist das Verfahren der Lichtabgabe auf andere systems einschließlich Einzel Mitochondrien oder mehrere physiologisch relevanten organotypischen Kulturmodellen und könnte verwendet werden, um Auswirkungen auf eine Reihe von Zielkriterien des oxidativen Stoffwechsels zu bewerten.
Introduction
Für eine Reihe von Signalwegen und normale Reaktionen des Zellstoffwechsels, einschließlich der Neuroprotektion 1 sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erforderlich. Wenn jedoch endogenen antioxidativen Mechanismus nicht in der Lage, die Produktion von ROS zu steuern, Zellen gegenüber oxidativem Stress 2,3 erliegen. Nach Verletzung des ZNS, werden die damit verbundenen Anstieg in Gegenwart von ROS und oxidativer Stress vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Progression der Schädigung 4,5 spielen. Trotz der umfangreichen Reihe von Strategien zur Abschwächung oxidativen Stress, die beurteilt wurden, gibt es noch keine vollständig wirksam, klinisch relevante antioxidativen Strategien zur Dämpfung von ROS-Produktion und die damit verbundenen oxidativen Stress in der klinischen Anwendung folgende Neurotrauma 6. Deshalb ist die Abschwächung des oxidativen Stress bleibt ein wichtiges Ziel für die therapeutische Intervention 7.
Verbesserungen folgening R / NIR-LT sind in einer Vielzahl von Verletzungen und Erkrankungen einschließlich Senkung der kardialen Infarktgröße, renale und hepatische Komplikationen bei Diabetes, Netzhautdegeneration, ZNS-Verletzung und Schlaganfall 8, vielleicht durch die Reduzierung von oxidativem Stress berichtet. Insbesondere im Hinblick auf ZNS-Verletzung, haben präklinische Studien der Wirksamkeit von 670 nm Licht gute Effekte in Modellen der Netzhautdegeneration 9-11, Verletzungen des Rückenmarks 12, neuronalen Tod 13 gezeigt. Klinische Studien haben für trockene altersbedingte Makuladegeneration durchgeführt worden und werden derzeit für einen Schlaganfall 14, aber die Ergebnisse dieser Studien nicht vielversprechend erscheinen, möglicherweise aufgrund eines Fehlers zu einer wirksamen Behandlung beschäftigen Parameter 15. Als solche R / NIR-LT, nicht sehr stark im Rahmen der normalen klinischen Praxis bei Neurotrauma angenommen, obwohl sie eine leicht zu verwalten, nicht-invasive und relativ kostengünstige Behandlung. Hindernisse für klinische Umsetzung gehören der Mangel an einem clAnfang verstanden Wirkmechanismus und das Fehlen eines standardisierten effektiven Behandlungsprotokoll 16,17. Aktuelle Literatur in Bezug auf die Lichttherapie zeigt eine Fülle von Variationen in der Behandlungsparameter in Bezug auf Strahlungsquellen (LED oder Laser), Wellenlänge (zB 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm) Gesamtdosis (Joule-Bestrahlung / Flächeneinheit), Dauer (Belichtungszeit), Zeitpunkt (vor oder nach dem Insult), Behandlungshäufigkeit und Art der Lieferung (Puls oder kontinuierlich) 8. Die Variabilität der Behandlungsparameter zwischen den Studien einen Vergleich schwierig und hat zu Skepsis gegenüber der Wirksamkeit 16 beigetragen.
Daher wird die Optimierung der R / NIR-LT eindeutig erforderlich, mit Zellkultursystemen, die zur High-Throughput-Screening-Mechanismus notwendig, um die mehreren Variablen zu vergleichen ist. Allerdings gibt es nur wenige handelsübliche Beleuchtungssysteme, die eine ausreichende Flexibilität und Kontrolle über wa bieten kannvelength und Intensität, solche Optimierungsversuche durchzuführen. Kommerziell erhältliche LED-Vorrichtungen sind im Allgemeinen nicht in der Lage, mehrere Wellenlängen oder Intensitäten, was Forscher die mehrere LED-Vorrichtungen von unterschiedlichen Herstellern, die nicht nur in der Intensität variieren kann, zu liefern, sondern auch das Spektrum der Wellenlänge des emittierten Lichts. Wir haben dieses Problem durch Verwendung eines Breitband-Xenon-Lichtquelle durch schmalbandige Interferenzfilter gefiltert, wodurch eine Reihe von Wellenlängen und Energiedichten von Licht, so dass in der Nähe, eine genaue Kontrolle der Parameter des R / NIR-LT gerichtet.
Es ist wichtig zu beachten, dass die therapeutische Dosis der Behandlung wird durch die Anzahl der Photonen, die Interaktion mit dem photoacceptor (Chromophor), die im Fall von R / NIR-LT wird postuliert, Cytochrom c Oxidase (COX) 18 werden definiert. Photonenenergie geliefert mit der Wellenlänge variiert; dh gleiche Dosen von Energie bei verschiedenen Wellenlängen werden comvon unterschiedlichen Anzahlen von Photonen geschätzt. Daher wurde das Licht von der Vorrichtung emittiert wird kalibriert, um eine gleiche Anzahl von Photonen für jede der gewählten Wellenlängen zu prüfenden emittieren. Wir haben ein System, das verwendet werden kann, um R / NIR-LT in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten zu Zellen in vitro zu liefern entwickelt und demonstriert die Fähigkeit, die Wirkungen des gelieferten R / NIR-LT auf ROS-Produktion in Zellen unterworfen zu messen Glutamat Stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben erfolgreich eine genaue und kalibrierte Lichtabgabesystem geeignet ist, einen Mechanismus für die Studie zur Optimierung der R / NIR-LT in vitro bereitzustellen. Wellenlängen- und Intensitätsparameter R / NIR-LT der Lage sind, mit diesem System genau und effektiv bearbeitet werden. Wir haben festgestellt, dass das Licht die Behandlung der Zellen nicht zum Zelltod führen, wenn auch ROS nicht bei den Wellenlängen und Dosierungen geliefert reduziert, in den getesteten Zelltypen. Höchstintensitäten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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