Méthode d'évaluation des effets d'une gamme de longueurs d'onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif<em> In Vitro</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
Rouge / thérapie lumière proche infrarouge (R / NIR-LT), délivré par laser ou diode électroluminescente (LED), améliore les résultats fonctionnels et morphologiques dans une gamme de blessures du système nerveux central in vivo, peut-être en réduisant le stress oxydatif. Cependant, on a montré des effets de R / NIR-LT sur le stress oxydatif varier en fonction de la longueur d'onde ou de l'intensité de l'irradiation. Les études comparant des paramètres de traitement font défaut, en raison de l'absence de dispositifs disponibles dans le commerce qui offrent de multiples longueurs d'onde ou intensités, adaptés à débit élevé mettre en études d'optimisation in vitro. Ce protocole décrit une technique pour la livraison de la lumière dans une plage de longueurs d'onde et des intensités d'optimiser les doses thérapeutiques nécessaires pour un modèle de lésion donnée. Nous émettons l'hypothèse que de fournir un procédé de lumière, dans lequel les paramètres de longueur d'onde et d'intensité peuvent être facilement modifiés, pourrait faciliter la détermination d'une dose optimale de R / NIR-LT pour réduire les espèces réactives de l'oxygène(ROS) in vitro.
Lumière non cohérente au xénon a été filtré à travers des filtres d'interférence à bande étroite pour fournir des longueurs d'onde variables (longueurs d'onde centrales de 440, 550, 670 et 810 nm) et des fluences (8,5 x 10 -3 à 3,8 x 10 -1 J / cm 2) de la lumière à des cellules en culture. Sortie de lumière de l'appareil a été calibré pour émettre des doses thérapeutiques pertinentes quantiques, l'égalité de la lumière à chaque longueur d'onde. Les espèces réactives ont été détectés dans le glutamate a souligné les cellules traitées avec la lumière, en utilisant DCFH-DA et H 2 O 2 des colorants fluorescents sensibles.
Nous avons livré avec succès la lumière à une gamme de longueurs d'onde physiologiquement et thérapeutique et intensités pertinentes, à des cellules en culture exposées à glutamate comme un modèle de lésion du SNC. Alors que les influences de R / NIR-LT utilisées dans la présente étude n'a pas exercer un effet sur ROS généré par les cellules cultivées, la méthode de livraison lumière est applicable à d'autres systems y compris les mitochondries ou plus physiologiquement modèles de culture organotypique pertinentes isolé, et pourrait être utilisé pour évaluer les effets sur un éventail de mesures des résultats du métabolisme oxydatif.
Introduction
Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont nécessaires pour une série de voies de transduction de signaux et les réactions normales du métabolisme cellulaire, y compris ceux de la neuroprotection 1. Toutefois, lorsque le mécanisme antioxydant endogène sont incapables de contrôler la production de ROS, les cellules peuvent succomber à 2,3 stress oxydatif. Après une lésion du SNC, les augmentations liées à la présence des ROS et le stress oxydatif sont supposés jouer un rôle important dans la progression des dommages de 4,5. Malgré le nombre important des stratégies pour atténuer le stress oxydatif qui ont été évalués, il ne existe actuellement pas de stratégie anti-oxydantes complètement efficaces, cliniquement pertinentes pour atténuer la production de ROS et le stress oxydatif associé à l'utilisation clinique après six neurotraumatologie. Par conséquent l'atténuation du stress oxydatif reste un objectif important pour l'intervention thérapeutique 7.
Améliorations suiventR ing / NIR-LT ont été signalés dans un large éventail de blessures et les maladies, y compris réduction de la taille de l'infarctus du cardia, complications rénales et hépatiques pendant le diabète, la dégénérescence rétinienne, lésion du SNC et d'AVC 8, peut-être en réduisant le stress oxydatif. Se agissant en particulier lésion du SNC, des études précliniques d'efficacité de la lumière de 670nm ont montré de bons effets dans les modèles de dégénérescence rétinienne 9-11, des blessures de la moelle épinière 12, la mort neuronale 13. Les essais cliniques ont été menées pour l'âge sèche dégénérescence maculaire liée et sont actuellement en cours pour la course 14, mais les résultats de ces essais ne semblent pas prometteuses, peut-être due à une défaillance d'employer un traitement efficace des paramètres 15. En tant que tel, R / NIR-LT n'a pas été largement adopté dans le cadre de la pratique clinique normale dans neurotraumatologie, en dépit d'être un outil facile à administrer, non-invasive et le traitement relativement peu coûteux. Obstacles à l'application clinique comprennent le manque d'un cldébut mécanisme d'action et l'absence d'un effet de 16,17 protocole de traitement standard compris. La littérature actuelle concernant la thérapie de lumière révèle une pléthore de variation des paramètres de traitement à l'égard de sources d'irradiation (LED ou laser), longueur d'onde (par exemple, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), la dose totale (joules d'irradiation / unité de surface), la durée (temps d'exposition), le calendrier (de l'insulte avant ou après), la fréquence de traitement et le mode de livraison (impulsion ou continu) 8. La variabilité des paramètres de traitement entre les études rend la comparaison difficile et a contribué au scepticisme concernant l'efficacité 16.
Par conséquent, l'optimisation de la R / NIR-LT est clairement nécessaire, avec des systèmes capables de fournir le mécanisme de criblage à haut débit nécessaire de comparer les multiples variables culture cellulaire. Cependant, il existe quelques systèmes d'éclairage disponibles dans le commerce qui peuvent fournir la flexibilité et un contrôle suffisant sur wavelength et l'intensité pour effectuer ces expériences d'optimisation. Commercialement dispositifs LED disponibles ne sont généralement pas en mesure de fournir de multiples longueurs d'onde ou intensités, entraînant enquêteurs employant plusieurs appareils LED de différents fabricants, qui peuvent varier non seulement de l'intensité, mais aussi le spectre de longueur d'onde de la lumière émise. Nous avons abordé cette question en utilisant une source de lumière au Xénon à large bande filtré à travers des filtres d'interférence à bande étroite, générant ainsi une gamme de longueurs d'onde et influences de la lumière, ce qui permet à proximité, un contrôle précis des paramètres de R / NIR-LT.
Il est important de noter que la dose thérapeutique de traitement est définie par le nombre de photons qui interagissent avec la photoacceptor (chromophore) qui, dans le cas de R / NIR-LT est postulé comme la cytochrome c oxydase (COX) 18. énergie des photons livré varie avec la longueur d'onde; signifie doses égales de l'énergie à différentes longueurs d'onde sera comprisé des différents nombres de photons. Par conséquent, la lumière émise à partir du dispositif a été étalonné pour émettre un nombre égal de photons pour chacune des longueurs d'onde choisies à tester. Nous avons développé un système qui peut être utilisé pour délivrer R / NIR-LT à une gamme de longueurs d'onde et des intensités à des cellules in vitro et a démontré la capacité de mesurer les effets de la R livré / NIR-LT sur la production de ROS dans les cellules soumises à le stress glutamate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons adapté avec succès un système de distribution précise de la lumière et calibré pour fournir un mécanisme pour l'étude d'optimisation de la R / NIR-LT in vitro. Longueur d'onde et l'intensité de paramètres R / NIR-LT sont capables d'être manipulées avec précision et de manière efficace en utilisant ce système. Nous avons établi que le traitement lumière des cellules ne ont pas conduit à la mort cellulaire, bien que ROS ne ont pas été réduite au niveau des longu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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