التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
القدرة على تمييز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى الأسلاف العصبية تسمح دراسة آليات السيطرة على مواصفات العصبية فضلا عن جيل من أنواع الخلايا العصبية الناضجة لمزيد من الدراسة. في هذا البروتوكول وصفنا طريقة لتمايز ESC إلى الأسلاف العصبية باستخدام المصل خالية والثقافة أحادي الطبقة. هذه الطريقة قابلة للوكفاءة ويؤدي إلى إنتاج ~ 70٪ الخلايا الاصلية العصبية داخل 4-6 أيام. ويمكن تطبيقه على ESC من مختلف السلالات التى تزرع في إطار مجموعة من الشروط. يمكن السماح الأسلاف العصبية إلى مزيد من التفريق في الخلايا العصبية الوظيفية والدبقية أو تحليلها بواسطة المجهر، وتدفق تقنيات الخلوي أو الجزيئية. عملية التمايز هو قابل للالوقت الفاصل بين المجهر ويمكن الجمع مع استخدام خطوط مراسل لمراقبة عملية مواصفات العصبية. نحن نقدم تعليمات مفصلة حول إعداد وسائل الاعلام وكثافة الخلايا الأمثل للسماح للعملية بالبريد تطبيقها على معظم خطوط ESC ومجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية هي الخلايا المحفزة المستمدة من الجنين في وقت مبكر لديها القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الكبار بعد إعادة إلى الجنين مرحلة المناسب (خلال تشكيل كايميرا)، والحقن في مسانج أو نقص المناعة المضيفين (من خلال تشكيل مسخي) أو في المختبر تخضع لمنبهات المناسبة 1. وكان أول وصف التمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية في الأنساب العصبية في عام 1995 وشملت تشكيل المجاميع تعليق الخلايا (الهيئات مضغي، EBS) في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل تستكمل مع حمض الريتينويك محدثة التخلق 2-4. ومنذ ذلك الحين تم تطوير مجموعة متنوعة من البروتوكولات للسماح التمايز العصبي 5. لا يزال كثير من الاستفادة من التجميع، شارك في ثقافة الآخرين مع إحداث أنواع الخلايا وعدد تنطوي على استخدام المصل خالية سائل الإعلام. جميع البروتوكولات لديها مزايا علىالثانية عيوب والطبيعة المحددة لالعصبية أو الخلايا العصبية تنتج أيضا يختلف وفقا لبروتوكول المستخدمة.
وأضاف أن البروتوكول المثالي هو أن يكون قويا، للتحجيم والاستفادة من وسائل الإعلام وركائز محددة تماما، تكون قابلة للرصد غير الغازية لعملية التمايز ويؤدي إلى توليد السكان نقية من الأسلاف العصبية قادرة على أن تكون منقوشة بواسطة منبهات الخارجية والتفريق في جميع أنواع فرعية العصبية والدبقية مع الكفاءة العالية والعائد في وقت قصير نسبيا. في اثني عشر عاما الماضية لقد تم استخدام طريقة لتوليد الأسلاف العصبية والخلايا العصبية من الماوس ESC في منخفض الكثافة، والثقافة أحادي الطبقة ملتصقة خالية من المصل 10/06. هذا البروتوكول يحقق العديد من المعايير الواردة أعلاه: في أيدينا فإن كفاءة التمايز يتسق تماما على مدى سنوات عديدة ومتنوعة من خطوط الخلايا، فإنه يمكن زيادتها إلى أعلى أو أسفل (التي نستخدمها بنجاح السفن من لوحات 96-جيدا ل 15 سم القطر ديشيس) وسائل الإعلام المستخدمة هي واضحة المعالم. هذه العملية هي قابلة للالمجهر timelapse لرصد التمايز ومجموعة متنوعة من العظة الزخرفة ويمكن أن يضاف للحث على توليد أنواع متميزة من الأنواع الفرعية العصبية (على سبيل المثال، Shh على وFgf8 عن الخلايا العصبية الدوبامين 6).
ومع ذلك، هناك بعض التحديات التي تواجه التطبيق الناجح لهذا البروتوكول. أحد الجوانب الرئيسية لإعداد دقيق وسائل الإعلام. نحن دائما بتحضير وسائل الإعلام في المنزل على الرغم من توافر البدائل التجارية. واحدة من المكملات الغذائية المستخدمة (N2؛ انظر البروتوكول) لديها تعديلات على مستوى الإصدارات المتوفرة تجاريا. أخيرا، واحدة من أهم الخطوات لنجاح تطبيق هذا الأسلوب هو كثافة الخلية المثلى في الطلاء. هذا هو السبب الرئيسي في حين تتطلب طبيعة autocrine واحدة من الإشارات المحفزة (Fgf4 11) أن خلايا كافية موجودة للسماح viabil الأمثلهو ضعف إيتي والتمايز، بكثافات عالية جدا التمايز (ربما يرجع ذلك جزئيا إلى إنتاج autocrine من LIF 12). ولذلك فمن المهم أن إعداد كل من وسائل الإعلام وطلاء الخلية تتم بعناية وباستمرار لضمان أفضل النتائج.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان بروتوكول التمايز العصبي أحادي الطبقة في استخدام لأكثر من عقد 6. البروتوكول هو ذات كفاءة عالية، ويتألف من متوسطة محددة، وذلك في ظل نظام أحادي الطبقة مما يجعل النظام أكثر قابلية للتطبيق لما قبل السريرية (على سبيل المثال، فحص المخدرات) يستخدم. ومع ذلك، هنا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
