يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام طريقة أحادية الطبقة الخالية من المصل. يمكن استخدام هذه الأسلاف لاشتقاق أنواع الخلايا العصبية الناضجة أو لدراسة عملية المواصفات العصبية وهي قابلة لتحجيم تنسيق متعدد الآبار للفحص المركب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القدرة على تمييز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى الأسلاف العصبية تسمح دراسة آليات السيطرة على مواصفات العصبية فضلا عن جيل من أنواع الخلايا العصبية الناضجة لمزيد من الدراسة. في هذا البروتوكول وصفنا طريقة لتمايز ESC إلى الأسلاف العصبية باستخدام المصل خالية والثقافة أحادي الطبقة. هذه الطريقة قابلة للوكفاءة ويؤدي إلى إنتاج ~ 70٪ الخلايا الاصلية العصبية داخل 4-6 أيام. ويمكن تطبيقه على ESC من مختلف السلالات التى تزرع في إطار مجموعة من الشروط. يمكن السماح الأسلاف العصبية إلى مزيد من التفريق في الخلايا العصبية الوظيفية والدبقية أو تحليلها بواسطة المجهر، وتدفق تقنيات الخلوي أو الجزيئية. عملية التمايز هو قابل للالوقت الفاصل بين المجهر ويمكن الجمع مع استخدام خطوط مراسل لمراقبة عملية مواصفات العصبية. نحن نقدم تعليمات مفصلة حول إعداد وسائل الاعلام وكثافة الخلايا الأمثل للسماح للعملية بالبريد تطبيقها على معظم خطوط ESC ومجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.
المقدمة
الخلايا الجذعية الجنينية هي الخلايا المحفزة المستمدة من الجنين في وقت مبكر لديها القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الكبار بعد إعادة إلى الجنين مرحلة المناسب (خلال تشكيل كايميرا)، والحقن في مسانج أو نقص المناعة المضيفين (من خلال تشكيل مسخي) أو في المختبر تخضع لمنبهات المناسبة 1. وكان أول وصف التمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية في الأنساب العصبية في عام 1995 وشملت تشكيل المجاميع تعليق الخلايا (الهيئات مضغي، EBS) في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل تستكمل مع حمض الريتينويك محدثة التخلق 2-4. ومنذ ذلك الحي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وسائل الإعلام
ملاحظة: بروتوكول يعتمد على استخدام مزيج من اثنين منفصلة وسائل الإعلام: DMEM / F12 تستكمل مع تعديل الملحق N2 وNeurobasal تستكمل مع B27 الملحق، وعادة في نسبة 1: 1.
- إعداد N2 ملحق تعديل عن طريق خلط المكونات في أنبوب 15 مل. لا الدوامة أو تصفية هذا؛ مزيج من قبل قلب الأنبوب حتى حل واضح.
- بدء بواسطة pipetting 7.2 مل من DMEM / F12، ثم يضاف 1 مل من 25 ملغ / مل الأنسولين (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه التجربة، استخدمنا خط خلية 46C 14، الخلايا الجذعية الجنينية مع مراسل Sox1-GFP الذاتية، لتعقب التمايز العصبي. باستخدام هذا الخط الخلية، تعبيرا عن Sox1، وهي علامة للحصول على السلف العصبي، ويمكن الكشف عنها بواسطة مخضر. تصفيح كثافة يشكل عاملا حاسما لتحقيق تمايز الخلايا العصبية. كانت مطلية الخلايا الجذعية الجنينية في لوحة 6 جيدا بكثافات مختلفة تتراوح بين 10500 إلى 88500 خلية / سم 2. ويبين الشكل 1A الكفاءة التمايز التي كتبها كثافة الطلاء المخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كان بروتوكول التمايز العصبي أحادي الطبقة في استخدام لأكثر من عقد 6. البروتوكول هو ذات كفاءة عالية، ويتألف من متوسطة محددة، وذلك في ظل نظام أحادي الطبقة مما يجعل النظام أكثر قابلية للتطبيق لما قبل السريرية (على سبيل المثال، فحص المخدرات) يستخدم. ومع ذلك، هناك بعض العوامل الحاسمة التي تحدد كفاءة التمايز. وتشير هذه المادة من تلك العوامل والحل لكل عقبة.
كثافة الخلايا بعد الطلاء في حالة التمايز ورب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل العمل من خلال منحة دراسية لتطوير وتعزيز العلوم والتكنولوجيا من وزارة التعليم التايلاندية إلى WW ومنح من Tenovus و Anonymous Trust إلى M.P.S.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصل الأبقار الجنيني | تقنيات الحياة | 10270-106 | |
| DMEM / F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| تقنيات الحياة | المتوسطة العصبية القاعدية | 21103-049 | |
| تقنيات كاشف تفكك الخلايا StemPro Accutase | تقنيات الحياة | A11105-01 | |
| B-27 ، تقنيات الحياة الخالية من المصل | 17504-044 | ||
| الأنسولين | Sigma | I6634 | إعادة التكوين مع معقم 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | إعادة التكوين بالماء المعقم |
| البروجسترون | Sigma | P8783 | إعادة التكوين مع الإيثانول |
| Putrescine | Sigma | P5780 | إعادة التكوين بالماء المعقم |
| سيلينيت الصوديوم | Sigma | S5261 | إعادة التكوين بالماء المعقم |
| جزء الألبومين البقري V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | تأكد من إذابته تماما قبل الاستخدام لأن الجلوتامين عادة ما يكون مترسب |
| الجيلاتين | Sigma | G1890 | |
| طبق زراعة الأنسجة ذو 6 آبار | Thermo Scientific | 140675 | |
| طبق زراعة الأنسجة 24 بئرا | Thermo 142475 | ||
| طبق زراعة الأنسجة 96 بئر | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية | Life | Technologies 11140-050 | |
| Sodium Pyruvate | Life | Technologies 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| عامل مثبط لسرطان الدم | أعدت في المنزل كما هو الحال في سميث 1991 مجلة طرق | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4 & prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | حماية من ضوء |
| الفأر المضاد & بيتا; III التوبولين IgG الجسم المضاد | Covance | MMS-435P | |
| الأجسام المضادة للفأر IgG ذات العلامات الفلورية | تقنيات الحياة | A31571 | الحماية من الضوء |
| 25 سم 2< / sup> قارورة ثقافة الأنسجة | Thermo Scientific | 156367 |
المراجع
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
