Abstract
神経前駆細胞にマウス胚性幹細胞(ESC)の分化する能力は、神経の仕様を制御する機構の研究だけでなく、さらなる研究のために成熟した神経細胞型の生成を可能にします。このプロトコルでは、無血清、単層培養を用いて、神経前駆細胞へのESCの分化のための方法を説明します。この方法は効率的で、拡張可能であり、4内の70%の神経前駆細胞〜の産生をもたらす - 6日。これは、様々な条件下で成長させた様々な株からESCに適用することができます。神経前駆細胞は、機能性ニューロンおよびグリアへとさらに分化させ、または顕微鏡検査によって分析し、フローサイトメトリーまたは分子技術を流すことができます。分化過程をタイムラプス顕微鏡検査に適していると神経仕様プロセスを監視するためのレポーター系の使用と組み合わせることができます。私たちはBに処理を可能にするために、メディアの準備と細胞密度の最適化に関する詳細な指示を与えますEは最もESC株および細胞培養容器の様々な適用しました。
Introduction
胚性幹細胞(キメラを形成することによって)適切な段階の胚に再導入後のすべての成体細胞型に分化する能力を保持しながら、in vitroで無限に増殖する能力を有する初期胚から誘導された多能性細胞、同系または免疫無防備状態の宿主に注入されています適切な手がかりに(奇形腫を形成することにより)、またはインビトロ 、対象における 1。神経系統へのマウス胚性幹細胞のin vitroでの分化は、1995年に初めて記載され、モルフォゲン、レチノイン酸2-4を補った血清含有培地中の多細胞懸濁凝集体(胚様体に、EB)の形成を関与していました。それ以来、種々のプロトコルは、神経分化5を可能にするために開発されてきました。まだ凝集を利用する多くの、他の細胞型を誘導するとの共培養を、いくつかの無血清培地の使用を含みます。すべてのプロトコルの利点持っていますND欠点及び神経または神経細胞の正確な性質は、また、使用するプロトコルに応じて変化する生じました。
理想的なプロトコルは、堅牢で拡張性の高い、完全に定義された培地と基質を利用する、分化過程の非侵襲的モニタリングに適して、外部の手がかりによってパターニングすることができる神経前駆細胞の純粋な集団の生成をもたらすと区別するためであろう比較的短時間で高効率と収率で、すべてのニューロンとグリアサブタイプに。最後の十年では、低密度、無血清の接着性単層培養6-10にマウスESCから神経前駆細胞と神経細胞を生成するための方法を使用しています。このプロトコルは、上述した多くの基準を満たす:我々の手に分化効率は、長年にわたって非常に一貫しており、種々の細胞株は、スケールアップすることができ、またはダウン(我々が正常に96ウェルプレートから容器を用います直径15cmジシーズ)と使用するメディアは、明確に定義されています。プロセスは、(ドーパミン作動性ニューロン6のために、例えば、ShhのとFGF8)ニューロンのサブタイプの別個の種類の生成を誘導するために添加することができる分化のモニタリングおよびパターニング手がかりの様々なタイムラプス顕微鏡に適しています。
それにもかかわらず、このプロトコルの成功のアプリケーションにはいくつかの課題があります。重要な側面の一つは、メディアの入念な準備です。我々は常に商業選択肢の利用可能性にもかかわらず、社内メディアを準備します。使用サプリメントの一つ(N2; プロトコルを参照)は、標準的な市販のバージョンに比べて変更されています。最後に、この方法の成功した適用のために最も重要なステップの一つは、めっきに最適な細胞密度です。誘導信号(FGF4 11)のいずれかの自己分泌性質が最適viabilを可能にするのに十分な細胞が存在することを必要とするので、これは主に高すぎる密度分化における性と分化は、(おそらくLIF 12の自己分泌産生に起因する部分で)損なわれています。これは、培地調製および細胞のプレーティングの両方が最適な結果を保証するために慎重にかつ一貫して行われることが重要です。
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Protocol
1.メディアの準備
注:プロトコルは、2つの別のメディアのミックスの使用に依存している:変更されたN2サプリメントを補充したDMEM / F12とするNeurobasalは、典型的には1に、B27サプリメントで補充:1の比率。
- 15mlチューブに成分を混合することによって修正されたN2サプリメントを準備します。これをボルテックスしたりフィルタリングしません。溶液が透明になるまでチューブを転倒混和。
- (0.01 M HClに作られた)25 mg / mlのインスリンの1ミリリットルを加え、チューブを反転させてよく混ぜ、その後、DMEM / F12の7.2ミリリットルをピペットで起動します。溶液が透明になるまでには数分かかります。
- 100ミリグラムの1ミリリットルを追加/ mlの(水の中に作られた)アポトランスフェリン、0.6ミリグラム/ 33μlのミリリットルprogesternone(エタノール中に作られた)、水に作られた160 mg / mlの(1 M)プトレシン(100μlの)、水の中に作られた3ミリモルの亜セレン酸ナトリウム()10μlの7.5%ウシ血清アルブミンの666μlを、よくチューブを混ぜます。 -20℃で2.5ミリリットルに小分けとストア最大2ヶ月間C。
- メディアを準備します。
- DMEM / F12 250 mlにN2の2.5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。
- 神経基礎の250ミリリットルにメディアはB27サプリメントの5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。
- 1:1の比のステップ1.2.1と1.2.2からメディアをミックス。いくつかのケースでは1:3混合物は、(:ステップ1.2.4で1ミックス1のように補足した)必要な場合があります。
- ミックスにL-グルタミン(最終濃度0.2 mM)の2-メルカプトエタノール(最終濃度0.1 mM)の3.5μlを0.5 mlのを追加し、振盪せずによく混ぜます。 3週間まで4℃でメディアを格納し、光にさらすことは避けてください。この最終的なミックスはN2B27と呼ばれています。
- ゼラチン溶液を準備します。
- 15分間、121℃、15 psiで超純水、オートクレーブ中の1%ゼラチン溶液を準備します。それは、このために使用ボトルは洗浄剤や消毒剤から完全にクリーンであることが重要なので、新しいボトルがあることをお勧めしますこのために使用されるとしか使用の間、超純水でリンスされます。 50ミリリットルのアリコートに1%溶液を分注し、数ヶ月のために4℃で維持。
- 溶解するまで37℃の水浴中で1%ゼラチンのアリコートを温め、温かいリン酸緩衝食塩水(PBS)500ml中に加えます。十分に混合し、各ウェルまたはプレートの底をカバーするのに十分ピペット。少なくとも30分間コートにゼラチンを表面を許可します。
2.細胞をプレーティング
注:このプロトコルは、白血病阻害因子(LIF)で10%血清中で増殖させたマウスESC、LIFおよび骨形成タンパク質4(BMP4)またはMEKとGSK3阻害剤(2Iメディア)とLIFまたは無血清培地と血清代替に等しく適用されますでまたはLIFなしで。しかし、分化のタイミングおよび効率は、細胞培地(説明を参照)に依存して変化し得ます。ここに示した実験のために、我々はEGFPレポーターがOにノックした46CマウスESC株を(使用しました10%血清およびLIFとGMEM中で増殖させた内因性SOX1対立遺伝子のNE)。最適な結果のためには、細胞が解離し、N2B27培地中に再プレーティングすることが重要です。単にGMEM /血清/ LIFからN2B27にメディアの変更は、常に細胞を再プレートと比較して減少分化効率をもたらします。
- 10%血清、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、0.1 M 2-メルカプトエタノール、100ユニット/ mlのLIF 13 GMEM中で細胞を成長させます。 3日- 2かかりますT25培養フラスコにマウスESC、プレート1×10 6細胞のサブコンフルエント培養物を取得します。
- 明視野顕微鏡で細胞を観察します。細胞がサブコンフルエントと通過する準備ができたら、PBS中で2回、それらをすすぎます。細胞解離試薬の1ミリリットルを追加し、2インキュベーターに戻す - 5分。トリプシンおよび他の酵素は、細胞分離のために用いることができるが、めっき密度があることが必要となるので、それらはadju細胞接着に悪影響を与えることができSTED。
- 細胞がプレートから持ち上げるために始めているしたら、単一細胞懸濁液にそれらを取り除くために、容器をタップします。 15mlの遠心チューブに培地と細胞解離試薬およびピペットの10ミリリットルの合計に細胞を回収します。
- RTで3分間、300×gで細胞をスピン。
- 慎重に上清を吸引し、ピペッティングにより3ダウン予め温めておいたN2B27 10mlにペレットを再懸濁 - 5回。ダウンサスをピペットすると、チューブの側面にピペットは、泡を作成しないように。自動細胞カウンターまたは血球計数器で細胞をカウントし、濃度を記録します。
- 予め温めておいN2B27にウェルあたりするボリュームの単位当たりの細胞の所望の数を含む細胞懸濁液を準備します。 6ウェルディッシュ中で1cm 2当たり10,500細胞の密度( すなわち、6ウェル皿のウェル当たり1×10 5個の細胞)が最適です。 cm 2であり、PLAあたりの細胞の推奨数については、表1を参照してください。細胞培養容器の様々なティンメディアボリューム。
- 培養容器からゼラチンを吸引し、 表1で推奨密度とボリュームに応じて細胞懸濁液をプレート。これは中央に細胞を集中するようにプレートを旋回しないでください。 37℃、5%CO 2の湿潤インキュベーター内で培養を配置します。
- 新鮮N2B27で全てのメディアを交換することによって、2日 - すべての1のメディアを変更します。ピペットは、細胞を穏やかにフラッシュなどの密度に影響を与え、次の日に分化効率を低下させる可能性があります。めっき後の初期の生存率が悪い場合には、1で細胞をプレート:N2及びB27添加培地の3ミックスと最初の2日後N2B27に変更。細胞が分化するように開始され、4の内部(ここで使用46C細胞株におけるレポーターの緑色蛍光によって可視)SOX1の発現を示すべきである- 6日。
3.免疫蛍光染色
NOTE:プロトコルは、任意の容器型に適用することができます。各試薬の量は、6ウェルプレートのウェル毎に記載されており、任意の表面領域にスケーリングすることができます。再プレーティングは、その後低い生存能力にはお勧めしません。
- 分化培地を除去し、4%の500μL(v / v)のパラホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を固定、15分間放置します。
- 洗浄し、PBS-T(リン酸緩衝生理食塩水0.5%(v / v)のトゥイーン20)を2 mlの細胞透過性を2回。細胞を4℃で最長2ヶ月間、PBS-T中で維持することができます。
- 10%(二次抗体と同じ種に由来する)(v / v)の血清をPBS-T 1mlのPBS-Tを交換してください。任意の非特異的結合をブロックするために室温でロッカープレート上で1時間インキュベートします。
- 1時間後、PBS-Tを2 mlの細胞を2回洗浄し、(1希釈した10%の血清をPBS-Tで1000)、βIIIチューブリンに対する500μlのマウスIgGでインキュベートします。プレートロッカーに入れ、4℃でO / Nのままにしておきます。
- この段階から、常に血管を保護光から。次に(10%血清をPBS-T中の2μg/ mlに希釈した)蛍光標識抗マウスIgG抗体500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回洗浄します。室温で1時間プレートロッカーの上に置きます。
- その後、DAPIの500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回すすぎ(PBS-Tで0.5μg/ mlに希釈し)、5分間のままにします。
- 再び細胞を洗浄し、PBS-Tに保管してください。細胞を撮影する準備ができていると、4℃で2週間まで維持することができます。それは固定され、生細胞の、又は異なる時間に固定された細胞のGFPの強度を比較することは不適切であるので、GFPシグナルが経時フェード注意。
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Representative Results
この実験では、神経分化を追跡するために、内因性SOX1-GFPレポーターと46C細胞ライン14、マウス胚性幹細胞を使用します。この細胞株、SOX1の発現は、神経前駆細胞のマーカーを使用することにより、緑色蛍光により検出することができます。密度をメッキすることは、神経分化を達成するための重要な要因です。マウス胚性幹細胞は、10,500 88500個の細胞/ cm 2で変化する異なる密度で6ウェルプレートに播種した。 図1Aは、6ウェルプレート中の異なるめっき密度によって達成分化効率を示しています。分化の6日目に、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、ニューロンマーカーβIIIチューブリンについて染色しました。最適密度(10,500細胞/ cm 2)で、細胞は、神経前駆細胞およびニューロンに分化しました。これは、ニューロンマーカー、βIIIチューブリンに対するSOX1-GFPレポーターおよび免疫蛍光から緑色蛍光シグナルにより観察しました。見よWERメッキ密度が3日以内に細胞死をもたらしました。しかし、あまりにも高密度でプレーティング(> 36,500細胞/ cm 2)は 、緑色の細胞およびβIIIチューブリン陽性細胞の減少割合をもたらした。 図1Bは 、約10倍高い細胞密度を必要とし、96ウェルプレート中で行った実験を示しています最適な(155,000細胞/ cm 2)と(362500細胞/ cm 2)レベルすぎるコンフルエントに達します。
最適な濃度は、培地調製、培地成分および細胞バッチ、細胞型、または以前の培養条件の間で異なることができます。これは、各実験のためにプレーティング密度を最適化することをお勧めします。 表1は、最適化ステップに含まれている必要があり、さまざまなプラットフォームでの効果的なメッキ密度の範囲を提供します。 6日 - この範囲内では、4内の良好な分化効率を与える濃度を取得することが可能であるべきです。
分化Eの間にSCは徐々にその形態を変更してください。10,500細胞/ cm 2で6ウェルプレートにプレーティング後6日目に1日目から2に示す細胞とコロニーの形態を図 。細胞は、分化条件で培養し、毎日撮影しました。これは、培養条件の極端な変化による最初の数日間に有意な細胞死を見ることは珍しいことではありません。しかし、残りの細胞はまだ分化することができます。 4日目に、細胞は、まず登場SOX1-GFPレポーターからの緑色蛍光シグナルとして神経前駆細胞になることを始めました。しかし、6日目に、全ての細胞は、SOX1陽性です。いくつかの非神経細胞の存在が予想され、それにもかかわらず、適切な条件下で、細胞の大部分は、神経です。
図1.分化効率のプレーティング密度の効果。二つの異なりますSOX1-GFPレポーター細胞(46C)の濃度は、6日間のプロトコルに従ってプレートし、分化させました。 6ウェルプレート中で(A)分化。 (B)96ウェルプレート中の分化。スケールバー:100μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
分化プロセスの間に、図2の細胞形態。46C ESCを6ウェル培養プレート中で1cm 2当たり10,500個の細胞で分化した細胞の形態の変化を観察するために、毎日撮影しました。スケールバー:300μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
プラットフォーム | 効果的な濃度の範囲(セル/ cm 2) | プレートに細胞数の範囲 | 推奨される初期のメディア容量(μL) | 1日目の後に提案されたメディア容量(μL) |
6ウェルプレート | 10,500 - 36,500 | 99,750 - 346750 | 千 | 2,000 |
24ウェルプレート | 15,600 - 46800 | 29640 - 88920 | 500 | 千 |
96ウェルプレート | 103500 - 26万 | 33120 - 83200 | 100 | 200 |
表1は、様々な血管サイズの密度およびメディアボリュームメッキを示唆している。この表でメッキ密度は46Cの細胞株を用いて決定しました。最適な結果を得るためには、各個々のラインのプレーティング密度は形容詞なければならないことがありますusted。
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Discussion
単層神経分化プロトコルは、十年6オーバーのために使用されてきました。プロトコルが定義された媒体で構成され、前臨床のためのシステムをより適用になり、単層システムで行われ、非常に効率的である( 例えば、薬物スクリーニング)を使用しています。しかし、分化効率を決定するいくつかの重要な要因があります。この記事では、これらの要因と各障害物のためのソリューションを指摘しています。
分化状態でプレーティング後の細胞の密度は、おそらく最も重要な要因です。あまりにも低密度でプレーティングする細胞死につながるながらあまりに高密度に細胞をプレーティングすることは、分化効率を低下させます。この現象は、自己分泌成長因子シグナル伝達に起因する可能性が高いです。 FGF4は、MAPKカスケードを活性化し、ESCの分化11を駆動するオートクリン増殖因子です。 LIFは、ESCによって生産別のサイトカインです。これは、STAT3経路を活性化し、自己再生を促進します<SUP> 15。このプロトコルは、神経細胞を作るためにN2B27を利用します。 N2B27は、ESCの生存を可能にする様々な要因が含まれており、神経細胞の成長を促進し、神経分化6を阻害LIFまたはBMP4のいずれかが含まれていません。適切な密度では、FGF4及びLIFシグナル伝達の適切なバランスは、ESCが分化することを可能に維持されています。高密度で、オートクリンLIFおよびBMPの過剰量は、分化を阻害します。これとは対照的に、あまりにも低密度で細胞は、これらのかなり最少培地で生存障害を有します。分化せずに多数の細胞が現れたときに有意な細胞死が観察された場合、めっきセルの数の増加が必要であるのに対ししたがって、めっき数が、減少されるべきです。
細胞数に加えて、間接的にメッキ密度に影響を与えるいくつかの他の要因があります。第1の要因は、均一に表面に細胞を分配するために使用される技術に依存して、局所細胞濃度でありますエリア。我々は、それがウェルの中心に細胞を集中し、周辺部で密度が低くなりすぎ、一方、高すぎる中心に密度を作るので、よく渦巻くことは、理想的ではないことがわかりました。メッキ、またはプレートの左右にロッキングする前に、細胞と培地を混合する例えば他の混合技法は、推奨されています。また、容器が培養器内に配置されるとき、媒体の不均一な加熱は、同心リングパターンにおける細胞の分布を生じる、ウェルの中央に細胞を描画対流力を発生します。メッキ日に低いメディアボリュームは、この影響を低減することをお勧めします。 30分間培養器外板のままにすると、細胞は、均質なプレーティング密度を達成するのを助けることができ、混合前に培地をウォーミングアップと同様に、添付してみましょうします。
第二に、容器のタイプは、明らかにプレーティング密度。 図1に影響を与える/ウェルの細胞数は直線的に、SCAことができないことを示しています異なる容器の表面積に導か(換言すれば、セル/表面積の同じ番号は、すべての容器の種類に適用することはできません)。 (より大きな体積/面積比を有する)小さな血管は、媒体の凹面を行う媒体の表面張力、いわゆるメニスカスによってより影響を受けます。表面張力は、ウェルの縁部に細胞をプッシュし、中央の密度を減少させます。小血管内のメディアの音量が低いためまた、メディアは、対流力を減少させる、高速ウォームアップ。したがって、小血管内の細胞は、メニスカス効果によりエッジに移動し、対流力によって中央に移動しません。中央に最適な密度を得るために必要なメッキ密度が高いほど、容器したがって、小さいです。
第三に、細胞の状態は、めっきの前にも間接的にプレーティング密度と分化効率に影響を与えます。我々はいくつかの実験で最適な密度の変化を発見しました。実験と初日の高い死亡率は、効率的な分化に高い密度を必要としていました。血清およびLIFでESC培養物をナイーブ多能性細胞の異種集団、プライミングされた多能性細胞、および分化した細胞16の小さな数で構成されています。これらのタイプの細胞は、分化条件下で生存および分化する異なる能力を持っています。プロトコルは数字ではなく、細胞の状態を指示しているので、いくつかの実験は、予想よりも低い密度をもたらす、最初の数日で死亡するより分化した細胞で開始することがあります。この変動を回避するために、ESCの一貫した培養は各状態間の一定割合が維持されていることを確認する必要があります。
別に密度から、タイミングは、効率的な分化を達成するための別の要因です。この公報では、6日以内に神経前駆細胞の生成を記載しています。しかし、時間は、状態に応じて異なっていてもよいです出発ESC文化。上述したように、ESC培養物は、分化状態に異なって応答することができる混合集団です。細胞の生存も分化のタイミングだけでなく、培養組成物によって影響されます。このプロトコルは、LIFおよびBMP4、または2IおよびLIFを含むN2B27培地中で、例えば最もESC培養条件に適用することができます。より多くのナイーブ細胞が培養中に存在する場合は、より長い期間は、効率的な分化に必要になることがあります。ナイーブ細胞がプライミングされた状態に切り替え、その後、神経前駆細胞に分化するのに多くの時間を必要とするためです。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
Gelatine | Sigma | G1890 | |
6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
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