Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.
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Articolo metodologico
Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di differenziare le cellule staminali embrionali di topo (ESC) per progenitori neurali consente lo studio dei meccanismi di controllo specifica neurali nonché la generazione di tipi di cellule neuronali mature per ulteriori studi. In questo protocollo si descrive un metodo per la differenziazione di ESC per progenitori neurali usano senza siero, cultura monostrato. Il metodo è scalabile, efficiente e si traduce in produzione di circa il 70% di cellule progenitrici neurali entro 4-6 giorni. Esso può essere applicato a ESC da vari ceppi coltivate sotto una varietà di condizioni. Progenitori neurali possono essere autorizzati a differenziare ulteriormente in neuroni funzionali e glia o analizzati al microscopio, il flusso delle tecniche di citometria o molecolari. Il processo di differenziazione è suscettibile di microscopia time-lapse e può essere combinato con l'uso di linee giornalista per monitorare il processo di specifica neurale. Noi forniamo istruzioni dettagliate sulla preparazione dei media e l'ottimizzazione della densità cellulare per consentire il processo di Be applicato alla maggior parte delle linee ESC e una varietà di recipienti di coltura cellulare.
Introduzione
Le cellule staminali embrionali sono cellule pluripotenti derivate da embrione precoce con la capacità di proliferare indefinitamente in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi cellulari adulti seguenti reintroduzione in un apposito embrione stadio (formando una chimera), iniezione in singenici o immunocompromessi host (formando un teratoma) o in vitro soggetto a segnali appropriati 1. La differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali è stato descritto nel 1995 e prevedeva la formazione di aggregati multicellulari di sospensione (corpi embrionali, EBS) in mezzi ....
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Protocollo
1. Carta Preparazione
NOTA: Il protocollo si basa sull'utilizzo di una miscela di due distinti mezzi: DMEM / F12 addizionato con modificato supplemento N2 e Neurobasal supplementato con supplemento B27, tipicamente in un rapporto 1: 1.
- Preparare il supplemento N2 modificato mescolando i componenti in una provetta da 15 ml. Non vortice o filtrare questo; mescolare capovolgendo la provetta fino a quando la soluzione è limpida.
- Inizia pipettando 7,2 ml di DMEM / F12, quindi aggiungere 1 ml di 25 mg / ml di insulina (composta in 0,01 M HCl) e mescolare bene invertendo il tubo. Ci vogliono un paio di minuti fino a quand....
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Risultati
In questo esperimento, abbiamo utilizzato la linea cellulare 46C 14, le cellule staminali embrionali di topo con un endogena Sox1-reporter GFP, per monitorare la differenziazione neuronale. Utilizzando questa linea cellulare, espressione di Sox1, un marker per progenitore neuronale, può essere rilevata da fluorescenza verde. Placcatura densità è un fattore critico per raggiungere la differenziazione neuronale. Cellule staminali embrionali di topo sono stati placcati in 6 pozzetti a diverse densità che variano.......
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Discussione
Il protocollo di differenziamento neurale monostrato è stato in uso per oltre un decennio 6. Il protocollo è altamente efficiente, composto terreno specifico, e fatto in un sistema monostrato che rende il sistema più applicabile per preclinica (ad esempio, la selezione della droga) utilizza. Tuttavia, vi sono alcuni fattori critici che determinano l'efficienza differenziazione. Questo articolo sottolinea questi fattori e la soluzione per ogni ostacolo.
Densità delle c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Work è stato finanziato da una borsa di studio per lo Sviluppo e la Promozione della Scienza e della Tecnologia dal Ministero dell'Istruzione thailandese a W.W. e da sovvenzioni da Tenovus e dall'Anonymous Trust a M.P.S.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Medium neurobasale | Life Technologies | 21103-049 | |
| Reagente per dissociazione cellulare StemPro Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Integratore B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulina | Sigma | I6634 | Ricostituire con sterile 0,01 M HCl |
| Apo-transferrina | Sigma | T1147 | Ricostituire con acqua sterile |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Ricostituire con etanolo |
| Putrescina | Sigma | P5780 | Ricostituire con acqua sterile |
| Selenito di sodio | Sigma | S5261 | Ricostituire con acqua sterile |
| Frazione di albumina bovina V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutammina | Life Technologies | 25030-081 | Assicurarsi che sia completamente disciolta prima dell'uso poiché la glutammina è solitamente sedimentata |
| Gelatina | Sigma | G1890 | |
| Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti | Thermo Scientific | 140675 | |
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Thermo Scientific | 142475 | |
| Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Life Technologies | 11140-050 | |
| Piruvato di sodio | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | |
| Fattore inibitorio della leucemia | preparato internamente come in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) | Sigma | D9542 | Proteggere dalla luce |
| Mouse anti & beta; Anticorpo IgG della tubulina III | Covance | MMS-435P | |
| Anticorpo IgG anti-topo marcato con fluorescenza | Life Technologies | A31571 | Proteggere dalla luce |
| 25 cm2 pallone per coltura tissutale | Thermo Scientific | 156367 |
Riferimenti
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A....
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Ristampe e permessi
