Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
Het vermogen om muizen embryonale stamcellen differentiëren (ESC) neurale voorlopercellen maakt het onderzoek mogelijk van de mechanismen die neurale specificatie evenals de vorming van volwassen neurale celtypes voor verdere studie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor de differentiatie van ESC neurale progenitors behulp serumvrij monolaagkweek. De werkwijze is schaalbaar, efficiënt en resulteert in de productie van ~ 70% neurale cellen in 4-6 dagen. Het kan worden toegepast op ESC uit verschillende stammen onder verschillende omgevingsomstandigheden. Neurale voorlopercellen kunnen worden toegestaan verder te differentiëren naar functionele neuronen en glia en geanalyseerd door microscopie, flowcytometrie of moleculaire technieken. Het differentiatieproces vatbaar is voor time-lapse microscopie en kan gecombineerd worden met het gebruik van reporter lijnen naar de neurale specificatie te monitoren. Wij bieden gedetailleerde instructies voor media voorbereiding en celdichtheid optimalisatie om het proces naar be op de meeste ESC lijnen en diverse cel kweekvaten.
Introduction
Embryonale stamcellen zijn pluripotente cellen afkomstig van het vroege embryo met het vermogen om oneindig prolifereren in vitro behoud van het vermogen om te differentiëren in alle volwassen celtypes na herintroductie in een passend stadium embryo (door vorming van een chimeer), injectie in syngene of immuungecompromitteerde (door vorming van een teratoma) hetzij in vitro onder geschikte 1 cues. De in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen tot neurale lineages werd eerst beschreven in 1995 en omvatte de vorming van multicellulaire aggregaten suspensie (embryoid lichamen, EBS) in serum-bevattende media waaraan het morfogeen retinoïnezuur 2-4. Sindsdien is een aantal protocollen ontwikkeld om neurale differentiatie 5 toestaan. Velen nog gebruik aggregatie andere co-kweek met inducerende celtypes en verschillende gebruik worden gemaakt van serumvrij medium. Alle protocollen hebben voordelen van eennd nadelen en de precieze aard van neurale of neuronale cellen produceerde ook afhankelijk van het gebruikte protocol.
De ideale protocol zou robuust, schaalbaar en maak gebruik van volledig gedefinieerde media en substraten, zijn ontvankelijk voor non-invasieve bewaking van het differentiatieproces en resulteren in de vorming van zuivere populaties van neurale voorlopercellen kunnen worden gevormd door externe stimuli en differentiëren in alle neuronale en gliale subtypes met een hoog rendement en opgevangen in een relatief korte tijd. In de afgelopen tien jaar hebben we met een methode voor het genereren van neurale voorlopers en neuronen van de muis ESC in een lage dichtheid, serumvrije aanhangend monolaagcultuur 6-10. Dit protocol voldoet aan veel van de hierboven uiteengezette criteria: in onze handen de efficiëntie van differentiatie heel consequent gedurende vele jaren en een verscheidenheid van cellijnen is geweest, kan het worden opgeschaald of omlaag (we met succes gebruik van schepen van 96-well platen 15 cm diameter dishes) en de gebruikte media zijn goed gedefinieerd. Het proces vatbaar is voor timelapse microscopie voor de monitoring van de differentiatie en verschillende patronen signalen kunnen worden toegevoegd aan de vorming van verschillende typen neuronale subtypes induceren (bijv Shh en Fgf8 voor dopaminerge neuronen 6).
Toch zijn er een aantal uitdagingen voor de succesvolle toepassing van dit protocol. Een van de belangrijkste aspecten is een zorgvuldige voorbereiding van de media. We bereiden altijd media interne ondanks de beschikbaarheid van commerciële alternatieven. Een van de supplementen gebruikte (N2; zie Protocol) heeft wijzigingen in de standaard commercieel beschikbare versies. Tenslotte, een van de belangrijkste stappen voor een succesvolle toepassing van deze werkwijze is de optimale celdichtheid bij plating. Dit komt vooral omdat, terwijl de autocrine karakter van één van de inducerende signalen (Fgf4 11) vereist dat er voldoende cellen aanwezig om een optimale levensvatbaarheid mogelijk zijnteit en differentiatie, bij een te hoge dichtheden differentiatie is aangetast (eventueel gedeeltelijk te wijten aan autocriene productie van LIF 12). Het is daarom belangrijk dat beide media preparaat en cellen plating zorgvuldig uitgevoerd en consistent optimaal resultaat.
Protocol
Representative Results
Discussion
De monolaag neurale differentiatie protocol is in gebruik voor meer dan een decennium 6. Het protocol is zeer efficiënt, samengesteld als beschreven medium en uitgevoerd in een monolaag systeem dat het systeem toepasbaar voor preklinische maakt (bijvoorbeeld screening van geneesmiddelen) gebruikt. Er zijn echter een aantal belangrijke factoren die differentiatie efficiëntie te bepalen. Dit artikel wijst deze factoren en de oplossing voor elk obstakel.
Dichtheid van de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
