Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
Способность различать мышиных эмбриональных стволовых клеток (ESC), чтобы нейронных клеток-предшественников позволяет изучение механизмов, контролирующих нейронной спецификации, а также генерацию зрелых нервных типов клеток для дальнейшего исследования. В этом протоколе мы опишем метод для дифференциации ESC на нейронных клеток-предшественников с использованием бессывороточной, однослойной культуры. Метод является масштабируемым, эффективным и приводит в производстве ~ 70% нервных клеток-предшественников в течение 4 – 6 дней. Это может быть применен к ESC от различных штаммов, выращенных в различных условиях. Нейронные предшественники могут быть разрешены, чтобы дифференцировать далее в функциональных нейронов и глии или анализировали с помощью микроскопии, проточной цитометрии или молекулярных методов. Процесс дифференциации поддается покадровой микроскопии и могут быть объединены с использованием репортерных линий для мониторинга нейронный процесс спецификации. Мы предоставляем подробные инструкции по подготовке СМИ и оптимизации плотности клеток, чтобы процесс бе применяться для большинства ЭСК линий и различных культур клеток сосудов.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентные клетки, полученные из ранних эмбрионов со способностью размножаться неопределенно в пробирке при сохранении способности дифференцироваться во все типы клеток взрослого следующих реинтродукции в соответствующей стадии эмбриона (путем формирования химеру), инъекции в сингенных или иммунодефицитами (путем формирования тератомы) или в пробирке субъекта к соответствующим сигналам 1. Дифференциация в пробирке мышиных эмбриональных стволовых клеток в нервных линий была впервые описана в 1995 году и предусматривал формирование многоклеточных подвески агрегатов (эмбриональных органов, EBS) в сыворотке крови, содержащей среде с добавлением морфогена ретиноевой кислоты 2-4. С тех пор множество протоколов были разработаны, чтобы позволить нервной дифференциацию 5. Многие до сих пор используют агрегацию, другие совместного культивирования с индукции типов клеток и несколько включают использование сыворотки среде. Все протоколы имеют преимуществай недостатки и точный характер нервной или нейрональные клетки продуцировали также варьируется в зависимости от используемого протокола.
Идеальным протоколом будет надежная, масштабируемая и использовать в полной мере, определенных СМИ и субстратов, поддаваться неинвазивного мониторинга процесса дифференцировки и в результате генерации чистых популяций нервных клеток-предшественников, способных быть с рисунком внешних сигналов и дифференцировать во всех нейрональных и глиальных подтипов с высокой эффективностью и выходом за относительно короткое время. В последние двенадцать лет мы используем метод для генерации нейронных клеток-предшественников и нейроны от мыши ESC в низкой плотности, свободной от сыворотки приверженцем монослоя культуры 6-10. Этот протокол отвечает многим критериям, изложенным выше: в наших руках эффективность дифференциации была вполне согласуется в течение многих лет, и разнообразие клеточных линий, его можно масштабировать вверх или вниз (мы успешно использовать сосуды из 96-луночных планшетах с 15 см диаметр диShes) и средства массовой информации, используемые хорошо определены. Процесс поддается ИНТЕРВАЛ микроскопии для мониторинга и дифференциации различных паттерна сигналы могут быть добавлены, чтобы вызвать генерацию различных типов нейрональных подтипов (например, Shh и Fgf8 для дофаминергических нейронов 6).
Тем не менее, есть некоторые проблемы для успешного применения этого протокола. Одним из ключевых аспектов является тщательная подготовка средств массовой информации. Мы всегда подготовить СМИ в доме, несмотря на наличие коммерческих альтернатив. Один из добавок, используемых (N2, см Protocol) имеет модификации по сравнению со стандартной, коммерчески доступные версии. Наконец, один из самых важных шагов для успешного применения этого метода является оптимальная плотность клеток в обшивке. Это происходит главным образом из-за в то время как природа аутокринная одного из индуцирующих сигналов (Fgf4 11) требует, чтобы достаточные клетки присутствуют для оптимального viabilность и дифференциации, при слишком высокой плотности дифференциации ухудшается (возможно, частично из-за аутокринном производства LIF 12). Поэтому важно, что препарат обе среды и клеточной обшивки выполнены тщательно и последовательно, чтобы обеспечить оптимальные результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нейронная дифференциация протокол монослоя была в использовании на протяжении более десяти лет 6. Протокол является высокоэффективным, состоит из определенной среде, и сделано в системе однослойного что делает систему более применимой для доклинических (например, скрининг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
