Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i Serum-free enlagskultur
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
Evnen til å skille mus embryonale stamceller (ESC) til nevrale stamceller tillater studiet av mekanismene som kontrollerer nevrale beskrivelsen så vel som dannelsen av moden nervecelletyper for videre studier. I denne protokollen beskriver vi en fremgangsmåte for differensiering av nevrale stamceller ESC til ved anvendelse av serum-fritt, monolagskultur. Metoden er skalerbar, effektiv og resulterer i produksjon av ~ 70% nevrale stamceller innen 4-6 dager. Det kan brukes på ESC fra forskjellige stammer dyrket under forskjellige betingelser. Nevrale stamceller kan få lov til å skille videre inn funksjonelle nerveceller og gliaceller eller analysert ved mikroskopi, flowcytometri eller molekylære teknikker. Differensieringsprosessen er mottagelig for time-lapse mikroskopi og kan kombineres med bruk av rapportør linjer for å overvåke det nevrale spesifikasjonen prosessen. Vi gir detaljerte instruksjoner om media forberedelse og celletettheten optimalisering for å tillate at prosessen til be påføres på de fleste ESC linjer og en rekke cellekulturflasker.
Introduction
Embryonale stamceller er pluripotente celler avledet fra tidlig embryo med kapasitet til å proliferere in vitro på ubestemt tid og samtidig beholde evnen til å differensiere til alle voksne celletyper etter gjeninnføring i et passende trinn embryo (ved å danne en chimaera), injeksjon inn i syngeniske eller immunkompromitterte verter (ved å danne en teratom), eller in vitro under gjeldende signaler 1. Den in vitro differensiering av mus embryonale stamceller i nerve linjene ble først beskrevet i 1995, og som er involvert i dannelsen av flercellede opphengs aggregater (embryoide legemer, EBS) i serum-inneholdende medium supplert med morphogen retinsyre 2-4. Siden da har en rekke protokoller er blitt utviklet for å tillate nevrale differensiering 5. Mange fremdeles utnytte aggregering, andre ko-kultur med induserende celletyper og flere innebære bruk av serumfritt medium. Alle protokoller har fordeler ennd ulemper og nøyaktige natur neural eller nerveceller produsert også varierer i henhold til protokollen som brukes.
Det ideelle ville være robust protokoll, skalerbart og gjøre bruk av fullt definerte medier og substrater, være mottakelig for ikke-invasiv overvåking av differensieringsprosessen og resultere i generering av rene populasjoner av nevrale stamceller kan være mønstret av eksterne signaler, og for å differensiere inn i alle neuronale og gliale undergrupper med høy effektivitet og utbytte i en forholdsvis kort tid. I løpet av de siste tolv årene har vi brukt en metode for generering av nevrale stamceller og nevroner fra mus ESC i en lav tetthet, serum-free tilhenger enlagskultur 6-10. Denne protokollen oppfyller mange av kriteriene ovenfor: i våre hender effektiviteten av differensiering har vært ganske konsekvent over mange år, og en rekke cellelinjer, kan det bli skalert opp eller ned (vi lykkes med å bruke fartøy fra 96-brønners plater til 15 cm diameter dishes) og media som brukes er godt definert. Fremgangsmåten er mottagelig for timelapse mikroskopi for overvåking av differensiering og en rekke mønster signaler kan bli tilsatt for å indusere dannelsen av forskjellige typer av neuronale undertyper (f.eks Shh og Fgf8 for dopaminerge neuroner 6).
Likevel er det noen utfordringer til den vellykkede anvendelse av denne protokollen. En av de viktigste aspektene er grundige forberedelser av media. Vi forbereder alltid media in-house tross for tilgjengeligheten av kommersielle alternativer. En av kosttilskudd brukes (N2, se Protocol) har modifikasjoner over standard kommersielt tilgjengelige versjoner. Endelig er en av de viktigste trinn for vellykket bruk av denne metoden er den optimale celletettheten ved plating. Dette er hovedsakelig fordi mens den autokrine karakter av en av de induserer signaler (Fgf4 11) krever at tilstrekkelig antall celler er til stede for å tillate optimal viabilligheten og differensiering, ved for høye tettheter differensiering er svekket (muligens delvis på grunn autocrine produksjon av LIF 12). Det er derfor viktig at både media forberedelse og celle plating utføres nøye og konsekvent for å sikre optimale resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monolaget nevrale differensiering protokollen har vært i bruk i over et tiår 6. Protokollen er svært effektiv, sammensatt av definert medium, og utført i et monosjikt system som gjør systemet mer anvendelig for preklinisk (f.eks narkotika screening) bruker. Det er imidlertid noen kritiske faktorer som bestemmer differensiering effektivitet. Denne artikkelen påpeker disse faktorene og løsningen for hvert hinder.
Tettheten av cellene etter utplating i differensiering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
