Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i Serumfri enskiktskultur
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
Förmågan att differentiera mus embryonala stamceller (ESC) för att neurala stamceller tillåter studiet av de mekanismer som styr neurala specifikation samt generering av mogna neurala celltyper för vidare studier. I detta protokoll beskriver vi en metod för differentiering av ESC neurala stamceller med hjälp av serumfritt, monokultur. Metoden är skalbar, effektiv och resulterar i produktion av ~ 70% neurala stamceller inom 4 – 6 dagar. Det kan appliceras på ESC från olika stammar som odlats under olika förhållanden. Neurala stamceller kan tillåtas att differentiera vidare till funktionella neuroner och glia eller analyseras av mikroskopi, flödescytometri eller molekylära tekniker. Differentieringsprocessen är mottaglig för tidsförlopp mikroskopi och kan kombineras med användning av reporterlinjer för att övervaka den neurala specifikationsprocessen. Vi ger detaljerade anvisningar om förberedelse medier och celltäthet optimering för att låta processen be tillämpas på de flesta ESC linjer och en mängd olika cellkulturkärl.
Introduction
Embryonala stamceller är pluripotenta celler som härrör från det tidiga embryot med förmågan att föröka sig i oändlighet in vitro med bibehållen förmåga att differentiera till alla typer vuxen cell efter återinförande i ett lämpligt skede embryo (genom att bilda en chimär), injektion i syngena eller nedsatt immunförsvar värdar (genom att bilda en teratom) eller in vitro omfattas av lämpliga signaler 1. In vitro-differentiering av Mouse embryonala stamceller i neurala linjer beskrevs första gången 1995 och innebar bildandet av flercelliga upphängningsaggregat (embryoidkroppar, EBS) i seruminnehållande medium kompletterat med morfogenen retinsyra 2-4. Sedan dess har en mängd olika protokoll har utvecklats för att möjliggöra neural differentiering 5. Många fortfarande utnyttja aggregering, andra co-kultur med inducerande celltyper och flera involverar användningen av serumfritt medium. Alla protokoll har fördelar ennd nackdelar och den exakta arten av neurala eller nervceller produceras också varierar beroende på vilket protokoll som används.
Den ideala protokollet skulle vara robust, skalbar och använda sig av helt definierade medier och substrat, vara mottaglig för icke-invasiv övervakning av differentieringsprocessen och resulterar i genereringen av rena populationer av neurala stamceller kan vara mönstrad genom yttre signaler och differentiera i all neuronala och gliaceller subtyper med hög effektivitet och utbyte på relativt kort tid. Under de senaste tiotal åren har vi använt en metod för att generera neurala stamceller och nervceller från mus ESC i en låg densitet, serumfritt vidhäftande monolager kultur 6-10. Detta protokoll uppfyller många av de kriterier som anges ovan: i våra händer effektivitet differentiering har varit ganska konsekvent under många år och en mängd olika cellinjer, kan den skalas upp eller ner (vi framgångsrikt använder fartyg från 96-brunnsplattor till 15 cm diametern dishes) och media som används är väldefinierade. Processen är mottaglig för Timelapse mikroskopi för övervakning av differentieringen och en variation av mönstrings ledtrådar kan tillsättas för att inducera generering av distinkta typer av neuronala subtyper (t.ex., Shh och FGF8 för dopaminerga neuroner 6).
Det finns dock vissa utmaningar för framgångsrik tillämpning av detta protokoll. En av de viktigaste aspekterna är noggranna förberedelser av medierna. Vi förbereder alltid media i egen regi, trots att det finns kommersiella alternativ. En av de tillägg som används (N2, se protokollet) har ändringar över standarden kommersiellt tillgängliga versioner. Slutligen är en av de viktigaste stegen för framgångsrik tillämpning av denna metod den optimala celldensiteten vid plätering. Detta beror främst på medan den autokrina karaktär en av de inducerade signalerna (FGF4 11) kräver att tillräckligt många celler är närvarande för att tillåta optimal viabilhet och differentiering, vid för höga densiteter differentiering är nedsatt (möjligen delvis på grund av autokrin produktion av LIF 12). Det är därför viktigt att förberedelserna både media och cell plätering utförs noggrant och konsekvent för att garantera optimala resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mono neurala differentiering protokollet har varit i bruk i över ett decennium 6. Protokollet är mycket effektiv, sammansatt av definierat medium, och gjort på ett monoskikt-system, som gör systemet mer tillämplig för preklinisk (t.ex., läkemedelsscreening) använder. Det finns dock några kritiska faktorer som avgör differentiering effektivitet. Den här artikeln påpekar dessa faktorer och lösningen för varje hinder.
Densitet av cellerna efter utstrykning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
