Selectieve Uitputting van Microglia van Cerebellaire Korrel celkweken behulp L-leucine Methyl Ester
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
Het menselijk brein bestaat uit een geschatte 85 miljard neuronen en een verdere 85 miljard niet-neuronale cellen, waaronder glia 1. Vandaar de Griekse etymologie van 'glia "vertaald Engels zo – voor het grootste deel van de afgelopen 100 jaar neuroscientists zijn vooral gericht op de neuronale celpopulatie, geloven gliacellen weinig meer dan passieve steuncellen die structurele ondersteuning voor neuronen 'lijm'. Onlangs is het echter steeds duidelijker dat neuronale-gliale interacties veel fundamentele fundamentele aspecten van neurobiologie, neurofysiologie en het ontstaan en de progressie van vele neurodegeneratieve ziekten kunnen zijn. Cerebellaire granule cellen (CBC), de meest voorkomende homogene neuronale populatie in het menselijk brein, domineren het cerebellum en make-up meer dan 90% van de cellulaire bestanddelen. Bijgevolg zijn deze cellen zijn uitgebreid gebruikt in vitro modelsysteem voor thij bestuderen van neuronale ontwikkeling, functie en pathologie 2-6.
Echter, CGC culturen bevatten nog steeds microglia en andere glia in aantoonbaar significante proporties. Hierdoor kan CGC data vermoedelijk weergave van de directe neuronale reacties op andere cel behandelingen daadwerkelijk optreden – gedeeltelijk of geheel – van de indirecte secundaire respons van naburige glia in de kweek. Om dit te bepalen, we selectief afgesplitst microgliale van CGC neuronale kweken met behulp van L-leucine methylester (LME). LME is een lysomotropic middel oorspronkelijk gebruikt om selectief te vernietigen macrofagen 7, en is sindsdien gebruikt om ook selectief afbrekende microglia van neurale, astrocyten, en gemengde gliale culturen 8,9,10. LME wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij veroorzaakt lysosomale ontwrichting en daaropvolgende apoptose 13,14. Macrofagen en microglia zijn karakteristiek rijk aan lysosomen, waardoor ze particula zijnrly kwetsbaar bij blootstelling aan LME behandeling. Dit protocol biedt een krachtige, maar eenvoudige en gemakkelijke manier om de bijdrage van microglia in experimenten met behulp van CGC en andere neuronale / gliale cultuur systemen vast te stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste stappen voor de succesvolle selectieve eliminatie van microglia van CGC verzekeren en / of gemengde kweken zijn: 1) het handhaven van een steriele en gezonde CGC cultuur; 2) filter steriliseren van de LME-bevattend medium en terug de oplossing op pH 7,4; 3) het bijhouden van de ingehouden CGC media en LME-bevattende media bij 37 ° C naar heat shock te voorkomen; en 4) snel werken om de tijd cellen buiten de incubator gehouden verminderen.
We gebruikten 25 mM LM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ, ., Winkler, S., Pfeiffer SE, . Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
