El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
El cerebro humano comprende un estimado de 85 mil millones de neuronas y otras 85 mil millones de células no neuronales incluyendo glia 1. Para la mayor parte de los últimos 100 años los neurocientíficos se han centrado principalmente en la población de células neuronales, creyendo células gliales a ser poco más que las células de apoyo pasivos que proporcionan soporte estructural para las neuronas – de ahí la etimología griega de 'glia' traducida al Inglés como "pegamento". Recientemente, sin embargo, se ha vuelto cada vez más evidente que las interacciones neuronales glial pueden ser mucho más fundamental a los aspectos básicos de la neurobiología, la neurofisiología, y la génesis y progresión de muchas enfermedades neurodegenerativas. Células granulares del cerebelo (CGC), el más abundante población neuronal homogénea en el cerebro humano, dominan el cerebelo y constituyen más del 90% de sus componentes celulares. En consecuencia, estas células se han utilizado ampliamente in vitro como un sistema modelo para tque estudian el desarrollo neuronal, la función y patología 2-6.
Sin embargo, los cultivos de CGC aún contienen microglia y otra glía en proporciones posiblemente significativas. Como resultado, los datos CGC que muestran supuestamente respuestas neuronales directos a diferentes tratamientos con células pueden, de hecho surgir – en parte o en total – a partir de la respuesta secundaria indirecta de la glía vecino en el cultivo. Para evaluar esto, hemos eliminado selectivamente microglial de CGC cultivos neuronales con la ayuda de éster metílico de L-leucina (LME). LME es un agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente los macrófagos 7, y desde entonces ha sido utilizado también para agotar selectivamente microglia desde neural, astrocitos, y los cultivos gliales mixtos 8,9,10. LME es internalizado por los macrófagos y microglia, en el que se provoca la interrupción lisosomal y la posterior apoptosis 13,14. Los macrófagos y microglia son característicamente rico en lisosomas, haciendo que sea particularly vulnerables a la exposición a un tratamiento de LME. Este protocolo proporciona una forma potente, pero simple y fácil de determinar la contribución de la microglia en experimentos que utilizan CGC y otros sistemas de cultivos neuronales / gliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes para garantizar la eliminación selectiva de éxito de la microglia de CGC y / o cultivos mixtos son: 1) el mantenimiento de una cultura CGC estéril y saludable; 2) Filtro de esterilizar el medio que contiene LME-y devolver la solución a pH 7,4; 3) mantenimiento de los medios de comunicación CGC retenidas y LME-que contiene los medios de comunicación a 37 ° C para evitar el choque térmico; y 4) que trabajan rápidamente para reducir el tiempo las células se mantienen fuera …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
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