L'esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Summary

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Abstract

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis^13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.

Introduction

Il cervello umano è composto una stima di 85 miliardi di neuroni e un ulteriore 85 miliardi di cellule non neuronali tra cui glia ^1. Per la maggior parte degli ultimi 100 anni i neuroscienziati si sono concentrati prevalentemente sulla popolazione delle cellule neuronali, cellule gliali credendo di essere poco più di cellule di supporto passivi che hanno fornito supporto strutturale per i neuroni – da qui l'etimologia greca del 'glia' tradotto in inglese come 'colla'. Recentemente, tuttavia, è diventato sempre più evidente che le interazioni neuronali gliali possono essere molto più fondamentale per aspetti fondamentali della neurobiologia, neurofisiologia, e la genesi e progressione di molte malattie neurodegenerative. Cellule cerebellari granulari (CGC), il più abbondante popolazione neuronale omogenea nel cervello umano, dominano il cervelletto e costituiscono oltre il 90% dei suoi componenti cellulari. Di conseguenza, queste cellule sono stati ampiamente utilizzati in vitro come sistema modello per tegli studio dello sviluppo neuronale, funzione e patologia ^2-6.

Tuttavia, le culture CGC contengono ancora microglia e glia altri in proporzioni probabilmente significativi. Di conseguenza, i dati che mostrano CGC putatively risposte neuronali scalo a trattamenti con le cellule differenti possono infatti insorgere – in tutto o in parte – dalla risposta secondario indiretta della vicina glia nella cultura. Per valutare questo, abbiamo selettivamente eliminato microglia da colture neuronali CGC con l'ausilio di estere metilico L-leucina (LME). LME è un agente lysomotropic originariamente utilizzato per distruggere selettivamente macrofagi ^7, e da allora è stato usato per esaurire anche selettivamente microglia da neurale, astrociti, e le culture gliali miste ^8,9,10. LME è interiorizzato da macrofagi e microglia, in cui esso provoca un'interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi ^13,14. Macrofagi e microglia sono caratteristicamente ricchi di lisosomi, causando loro di essere particularly vulnerabile in seguito all'esposizione al trattamento LME. Questo protocollo fornisce un modo potente, ma semplice e facile stabilire il contributo della microglia in esperimenti utilizzando altri sistemi di coltura gliali / neuronali CGC e.

Protocol

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle Regno Unito Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986. 1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti Preparare due forbici laboratorio in acciaio inox di dissezione e due pinze da laboratorio in acciaio inox. Autoclavare tutti gli strumenti e posto in una cappa di coltura O / N sotto luce (UV) ultravioletta per la sterilizzazione. Fate 500 ml di mezzi essenziali (MEM) terreno …

Representative Results

La capacità di questa tecnica per eliminare selettivamente microglia da CGC e / o colture miste si basa sulla successiva capacità del ricercatore di identificare accuratamente e differenziare microglia dalle celle circostanti. Ciò può essere ottenuto usando una macchina per cella specifica-microglia, come isolectin-B4, come illustrato in figura 1. Come mostrato nella Figura 2, nessun cambiamento osservabile astrociti e la densità neuronale e morfologia sono stati registrati con rif…

Discussion

I passi più importanti per assicurare l'eliminazione selettiva di successo di microglia da CGC e / o colture miste sono: 1) il mantenimento di una cultura CGC sterile e sano; 2) filtro sterilizzante medio LME contenente e ritornando la soluzione a pH 7,4; 3) mantenere i media CGC conservati e LME contenenti supporti a 37 ° C per evitare lo shock termico; e 4) che lavorano rapidamente per ridurre il tempo di cellule sono tenuti all'esterno dell'incubatrice.

Abbiamo …

Materials

Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	The curved end facilitates removal of the cerebellum
Micro-dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS solution	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coat coverslips 1 day before use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Mouse anti-ED1 antibody	Abcam	ab31630