L'esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Sommario

Le microglia possono influenzare i neuroni e altre gliali in coltura attraverso vari meccanismi autonomi non cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per esaurire selettivamente le microglia da colture neuronali primarie. Questo metodo ha il potenziale per chiarire il ruolo delle interazioni microgliali-neuronali, con implicazioni per le condizioni neurodegenerative in cui la neuroinfiammazione è una caratteristica distintiva.

Abstract

Le microglia, le cellule immunocompetenti residenti del SNC, svolgono un ruolo multiforme nella modulazione e nel controllo della funzione neuronale, oltre a mediare l'immunità innata. I modelli primari di colture cellulari di roditori hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione delle interazioni neuronali-gliali, ma solo di recente sono stati utilizzati metodi per eliminare specificamente la microglia da colture miste. Una di queste tecniche – qui descritta – è l'uso dell'estere metilico di L-leucina, un agente lisomotropo che viene internalizzato dai macrofagi e dalla microglia, in cui provoca l'interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi^13,14. Gli esperimenti che utilizzano l'estere metilico di L-leucina hanno il potere di identificare il contributo della microglia all'ambiente cellulare circostante in diverse condizioni di coltura. Utilizzando un protocollo ottimizzato nel nostro laboratorio, descriviamo come eliminare la microglia dalla coltura cellulare di granuli cerebellari di roditori P5. Questo approccio consente di valutare l'impatto relativo delle microglia sui dati sperimentali, nonché di determinare se le microglia svolgono un ruolo neuroprotettivo o neurotossico nei modelli di coltura di condizioni neurologiche, come l'ictus, l'Alzheimer o il morbo di Parkinson.

Introduzione

Il cervello umano è composto una stima di 85 miliardi di neuroni e un ulteriore 85 miliardi di cellule non neuronali tra cui glia ^1. Per la maggior parte degli ultimi 100 anni i neuroscienziati si sono concentrati prevalentemente sulla popolazione delle cellule neuronali, cellule gliali credendo di essere poco più di cellule di supporto passivi che hanno fornito supporto strutturale per i neuroni - da qui l'etimologia greca del 'glia' tradotto in inglese come 'colla'. Recentemente, tuttavia, è diventato sempre più evidente che le interazioni neuronali gliali possono essere molto più fondamentale per aspetti fondamentali della neurobiolo....

Protocollo

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle Regno Unito Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986.

1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti

1. Preparare due forbici laboratorio in acciaio inox di dissezione e due pinze da laboratorio in acciaio inox. Autoclavare tutti gli strumenti e posto in una cappa di coltura O / N sotto luce (UV) ultravioletta per la sterilizzazione.
2. Fate 500 ml di mezzi essenziali (MEM) terreno minimo cultura (10% fetale Bovine Serum [FBS], 20 mM KCl, 25 NaHCO mm _3, 30 mm D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100....

Risultati

La capacità di questa tecnica per eliminare selettivamente microglia da CGC e / o colture miste si basa sulla successiva capacità del ricercatore di identificare accuratamente e differenziare microglia dalle celle circostanti. Ciò può essere ottenuto usando una macchina per cella specifica-microglia, come isolectin-B4, come illustrato in figura 1. Come mostrato nella Figura 2, nessun cambiamento osservabile astrociti e la densità neuronale e morfologia sono stati registrati con riferime.......

Discussione

I passi più importanti per assicurare l'eliminazione selettiva di successo di microglia da CGC e / o colture miste sono: 1) il mantenimento di una cultura CGC sterile e sano; 2) filtro sterilizzante medio LME contenente e ritornando la soluzione a pH 7,4; 3) mantenere i media CGC conservati e LME contenenti supporti a 37 ° C per evitare lo shock termico; e 4) che lavorano rapidamente per ridurre il tempo di cellule sono tenuti all'esterno dell'incubatrice.

Abbiamo us.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinze	Sigma-Aldrich	F4142	L'estremità curva facilita la rimozione del cervelletto
Forbici per micro-dissezione	Sigma-Aldrich	S3146	La punta diritta e affilata facilita la dissezione del roditore P4-7
L-leucina metil estere cloridrato	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS soluzione	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coprioggetti 1 giorno prima dell'uso
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNasi	Sigma-Aldrich	D5025
Inibitore della tripsina di soia	Sigma-Aldrich	T6414
Anticorpo anti-ED1 per topo	Abcam	ab31630