Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
Человеческий мозг содержит оценкам, 85 миллиардов нейронов и дальнейшие 85 миллиардов без нервных клеток глии в том числе 1. Для большей части последних 100 лет неврологи, ориентированных преимущественно на нейронной популяции клеток, полагая, глиальные клетки, чтобы быть немного больше, чем пассивные поддерживающих клеток, которые представили структурную поддержку для нейронов – отсюда греческого этимологии "глии 'в переводе с английского, как "клей". Однако в последнее время, становится все более очевидным, что нейронные-глиальных взаимодействий может быть гораздо более фундаментальное значение для основных аспектов нейробиологии, нейрофизиологии и генезиса и прогрессирования многих нейродегенеративных заболеваний. Мозжечка ЗК (CGCs), наиболее распространенным однородная нейронная населения в человеческом мозге, доминировать в мозжечок и составляют более 90% своих клеточных составляющих. Следовательно, эти клетки широко используются в пробирке в качестве модельной системы для тон изучению развития нейронов, функции и патологии 2-6.
Тем не менее, CGC культуры по-прежнему содержат микроглии и других глии в возможно значительных пропорциях. В результате, данные, отображающие CGC предположительно прямые нейрональные ответов на различных обработок клеток на самом деле может возникнуть – в частично или полностью – от косвенного вторичной реакции соседних глии в культуре. Для оценки этого, мы селективно элиминируют микроглии от CGC нейрональных культур с помощью L-лейцина метилового сложного эфира (LME). LME является lysomotropic агент первоначально использовались выборочно уничтожать макрофагов 7, и с тех пор используется также выборочно разрушают микроглии от нервных, астроцитов и глиальных культур смешанных 8,9,10. ЛБМ интернализуется макрофагами и микроглии, в котором он вызывает нарушение лизосом и последующее апоптоз 13,14. Макрофаги и микроглии характерно богаты лизосом, заставляя их быть particulaжелезная дорога уязвимы при воздействии лечения LME. Этот протокол обеспечивает мощный, но простой и легкий способ удостовериться вклад микроглии в экспериментах с использованием CGC и другие нейронные системы / глиальные культуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для обеспечения успешного селективное удаление микроглии от CGC и / или смешанных культур являются: 1) поддержание стерильной и здоровый CGC культуры; 2) Фильтр стерилизации LME-среде, содержащей и возвращение раствора до рН 7,4; 3) ведение нераспределенной CGC массовой инфо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ, ., Winkler, S., Pfeiffer SE, . Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
