L-ロイシンメチルエステルを使用した小脳顆粒細胞培養物からのミクログリアの選択的枯渇
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
人間の脳は、推定850億のニューロンおよびグリア1を含むさらに850億非神経細胞を含みます。過去100年間の大部分のために神経科学者は、ニューロンのための構造的支持を提供した受動支持細胞より少しであることがグリア細胞を信じて、神経細胞集団に主に焦点を当てている – それ故に「グリア」のギリシャ語の語源は、英語に翻訳します「接着剤」。しかし最近では、それは、神経膠細胞の相互作用がはるかに根本的な神経生物学、神経生理学、および多くの神経変性疾患の発生および進行の基本的な側面になる可能性があることがますます明らかになりました。小脳顆粒細胞（CGCS）、ヒトの脳で最も豊富な均質なニューロン集団は、小脳を支配し、その細胞成分の90％以上を占めています。したがって、これらの細胞は、Tのためのモデル系として、in vitroで広範に使用されています彼は、神経発達、機能、および病理2-6の検討します。
しかし、CGC培養はまだ間違いなくかなりの割合でミクログリア及びその他のグリアが含まれています。その結果、推定される種々の細胞治療への直接神経細胞応答を表示するCGCデータは、実際に発生する可能性がある – 一部または全体で – 文化の中で、隣接するグリアの間接的な二次応答から。これを評価するために、我々は、選択的に、L-ロイシンメチルエステル（LME）の助けを借りてCGCニューロン培養物からミクログリアを除去しました。 LMEは、もともと選択マクロファージ7を破壊するために使用lysomotropic剤であり、以降も選択的神経、アストロサイト、および混合膠細胞培養8,9,10からミクログリアを枯渇させるために使用されてきました。 LMEは、リソソームを破砕した後、アポトーシス13,14を引き起こしており、マクロファージおよびミクログリアによって内在化されます。マクロファージおよびミクログリアは、彼らがparticulaであることを引き起こして、リソソームにおける特徴豊富ですLMEの治療に暴露されるとRLY脆弱。このプロトコルは、CGC、その他のグリア/ニューロンの培養系を利用した実験でミクログリアの貢献を把握するための強力な、まだシンプルで簡単な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
CGCからミクログリアの成功選択的除去を確実にするために最も重要なステップおよび/または混合培養物は、1）滅菌し、健康CGC文化を維持します。 2）フィルタは、LME含有培地を滅菌し、pHを7.4に溶液を戻します。 3）37に保持CGC媒体とLME含有培地を維持 ヒートショックを回避するため°C; 4）細胞をインキュベーターの外に保持される時間を短縮するために迅速に取り組ん。
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
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