अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल संस्कृतियों से Microglia के चुनिंदा रिक्तीकरण एल Leucine मिथाइल एस्टर का प्रयोग
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
मानव मस्तिष्क एक अनुमान के अनुसार 85 अरब न्यूरॉन्स और glia 1 सहित 85000000000 एक और गैर neuronal कोशिकाओं शामिल हैं। के रूप में अंग्रेजी में अनूदित 'glia' इसलिए ग्रीक व्युत्पत्ति – neuroscientists न्यूरोनल सेल की आबादी पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है पिछले 100 वर्षों से अधिक से अधिक भाग के लिए, glial कोशिकाओं विश्वास न्यूरॉन्स के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान की जाती है कि निष्क्रिय समर्थन कोशिकाओं की तुलना में थोड़ा अधिक हो 'गोंद'। हाल ही में, हालांकि, यह न्यूरोनल-glial बातचीत तंत्रिका जीव विज्ञान, Neurophysiology, और कई neurodegenerative रोगों की उत्पत्ति और प्रगति के बुनियादी पहलुओं के लिए कहीं अधिक मौलिक हो सकता है कि तेजी से स्पष्ट हो गया है। अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल कोशिकाओं (CGCs), मानव मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में समरूप न्यूरोनल आबादी, सेरिबैलम पर हावी है और अपने सेलुलर घटकों में से अधिक से अधिक 90% तक है। नतीजतन, इन कोशिकाओं टी के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इन विट्रो में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया हैवह न्यूरोनल विकास, समारोह, और विकृति 2-6 से अध्ययन करते हैं।
हालांकि, CGC संस्कृतियों अभी भी यकीनन महत्वपूर्ण अनुपात में microglia और अन्य glia होते हैं। नतीजतन, कथित अलग सेल उपचार के लिए सीधी न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित CGC डेटा वास्तव में उत्पन्न हो सकती है – भाग में या कुल में – संस्कृति में glia पड़ोसी के अप्रत्यक्ष माध्यमिक प्रतिक्रिया से। इस आकलन करने के लिए, हम चुनिंदा एल Leucine मिथाइल एस्टर (एलएमई) की सहायता से CGC neuronal संस्कृतियों से microglial सफाया कर दिया। एलएमई मूल रूप से चुनिंदा मैक्रोफेज 7 को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल एक lysomotropic एजेंट है, और के बाद से भी चुनिंदा तंत्रिका, अस्थिकणिका, और मिश्रित glial संस्कृतियों 8,9,10 से microglia खलाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एलएमई यह लाइसोसोमल विघटन और बाद में एपोप्टोसिस 13,14 का कारण बनता है, जिसमें मैक्रोफेज और microglia से भली भाँति है। मैक्रोफेज और microglia उन्हें particula होने के कारण, लाइसोसोम में विशेषता से समृद्ध कर रहे हैंएलएमई उपचार के लिए जोखिम पर रेलवे की चपेट में। इस प्रोटोकॉल CGC और अन्य न्यूरोनल / glial संस्कृति प्रणालियों का उपयोग प्रयोगों में microglia के योगदान का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली, अभी तक सरल और आसान तरीका प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण कदम CGC से microglia की सफल चयनात्मक उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए और / या मिश्रित संस्कृतियों हैं: 1) एक बाँझ और स्वस्थ CGC संस्कृति को बनाए रखने; 2) फिल्टर एलएमई युक्त मध्यम स्टरलाइज़ और 7.4 पीएच का ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
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