Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Den menneskelige hjerne består av anslagsvis 85 milliarder nevroner og en ytterligere 85 milliard ikke-nevronale celler inkludert gliaceller 1. For størstedelen av de siste 100 årene nevrologer har fokusert hovedsakelig på nevronale cellepopulasjon, å tro gliacellene være litt mer enn passive støtteceller som ga strukturell støtte for nervecellene – derav den greske etymologi 'gliaceller "oversettes til engelsk som "lim". Nylig, har det imidlertid blitt stadig tydeligere at nevronale-gliaceller interaksjoner kan være langt mer grunnleggende for grunnleggende aspekter av nevrobiologi, nevrofysiologi, og tilblivelsen og progresjon av mange nevrodegenerative sykdommer. Lillehjernen granule celler (CGCs), den mest tallrike homogen nevronale befolkningen i den menneskelige hjernen, dominerer cerebellum og utgjør mer enn 90% av sine cellulære bestanddeler. Følgelig har disse cellene vært brukt i stor utstrekning som et in vitro modellsystem for tHan studerer for nevronale utvikling, funksjon og patologi 2-6.
Men CGC kulturer fortsatt inneholde mikroglia og andre gliaceller i uten tvil betydelige proporsjoner. Som et resultat, kan data CGC putatively viser direkte neuronale responser på forskjellige celle behandlinger faktisk oppstår – delvis eller totalt – fra den indirekte sekundær respons av nabo gliaceller i kulturen. For å vurdere dette, vi selektivt fjernet fra microglial CGC nevronale kulturer ved hjelp av L-leucin-metylester (LME). LME er en lysomotropic middel opprinnelig brukt til å selektivt ødelegge makrofager 7, og har siden blitt brukt til å også selektivt utarme mikroglia fra nevrale, astrocyte, og blandet gliale kulturer 8,9,10. LME er internalisert av makrofager og mikroglia, hvor det fører lysosomale avbrudd og påfølgende apoptose 13,14. Makrofager og mikroglia er karakteristisk rik i lysosomer, forårsaker dem til å være particularly sårbar ved eksponering til LME behandling. Denne protokollen gir en kraftig, men likevel enkel og lett måte å fastslå bidrag mikroglia i eksperimenter utnytte CGC og andre nevronale / gliale kultursystemer.
De viktigste tiltak for å sikre en vellykket selektiv fjerning av mikroglia fra CGC og / eller blandede kulturer er: 1) å opprettholde et sterilt og sunn CGC kultur; 2) filtersterilisering LME-inneholdende medium og returnerer oppløsningen til pH 7,4; 3) holde tilbakeholdt CGC media og LME-holdige media ved 37 ° C for å unngå varme sjokk; og 4) som arbeider raskt for å redusere tiden celler holdes utenfor inkubatoren.
Vi brukte 25 mM LME å utarme mikroglia fra våre CGC …
The authors have nothing to disclose.
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |