Selektiv Utarmning av mikroglia från Cerebellar Granule cellkulturer Använda L-leucinmetylester

Summary

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Abstract

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis^13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.

Introduction

Den mänskliga hjärnan består av uppskattningsvis 85 miljarder nervceller och en ytterligare 85 miljarder icke-neuronala celler inklusive glia ^1. För större delen av de senaste 100 åren neuroforskare har fokuserat främst på den neuronala cellpopulationen, att tro gliaceller vara lite mer än passiva stödceller som föreskrivs strukturellt stöd till de nervceller – därav det grekiska etymologi av "glia" översätts till engelska "lim". Nyligen har det dock blivit allt tydligare att neuronala-gliaceller interaktioner kan vara långt mer grundläggande för grundläggande aspekter av neurobiologi, neurofysiologi, och uppkomsten och utvecklingen av många neurodegenerativa sjukdomar. Cerebellära granulatceller (CGC), den vanligast förekommande homogena neuronala befolkningen i den mänskliga hjärnan, dominerar lillhjärnan och utgör mer än 90% av sina cellbeståndsdelar. Följaktligen har dessa celler använts i stor omfattning in vitro som ett modellsystem för than studie av nervsystemets utveckling, funktion och patologi ^2-6.

Men CGC kulturer innehåller fortfarande mikroglia och andra glia i påstå betydande proportioner. Som ett resultat, CGC uppgifter förmodat visar direkta neuronala svar på olika cellbehandlingar kan faktiskt uppstå – delvis eller totalt – från det indirekta sekundära svaret angränsande glia i kulturen. För att bedöma detta, selektivt elimineras vi microglial från CGC neuronala kulturer med hjälp av L-leucinmetylester (LME). LME är ett lysomotropic agent ursprungligen användes för att selektivt förstöra makrofager ^7, och har sedan dess använts för att även selektivt utarma mikroglia från neurala, astrocyternas och blandade gliaceller kulturer ^8,9,10. LME internaliseras av makrofager och mikroglia, där det orsakar lysosomal störningar och efterföljande apoptos ^13,14. Makrofager och mikroglia är karaktäristiskt rikt på lysosomer, vilket får dem att vara particularly sårbara vid exponering för LME behandling. Detta protokoll ger en kraftfull, men ändå enkel och lätt sätt att fastställa bidrag mikroglia i experiment som använder CGC och andra neuronala / glia odlingssystem.

Protocol

Alla experiment som beskrivs häri utfördes i enlighet med Förenade kungariket Djur (vetenskapliga förfaranden) Act från 1986. 1. Framställning av instrument, Kultur Media och Rätter Bered två rostfritt stål laboratorium dissekera sax och två rostfria laboratorie pincett. Autoklav alla instrument och plats i en kultur huva O / N under ultraviolett ljus (UV) ljus för sterilisering. Gör 500 ml minimalt essentiellt medium (MEM) odlingsmedium (10% fetalt bovint se…

Representative Results

Förmågan hos denna teknik för att selektivt eliminera mikroglia från CGC och / eller blandade kulturer bygger på den efterföljande förmågan hos utredaren att exakt identifiera och särskilja mikroglia från deras omgivande celler. Detta kan uppnås med användning av en microglial-specifik cell maker, såsom isolectin-B4, såsom visas i fig 1. Såsom visas i fig 2, observerades inga observerbara förändringar av astrocyt och neuronal densitet och morfologi som spelats in med av…

Discussion

De viktigaste åtgärder för att säkerställa en framgångsrik selektiv eliminering av mikroglia från CGC och / eller blandade kulturer är: 1) att upprätthålla en steril och hälsosam CGC kultur; 2) filtersterilisering LME-innehållande mediet och återföring av lösningen till pH 7,4; 3) hålla de kvarhållna CGC media och LME-innehållande media vid 37 ° C för att undvika värmechock; och 4) arbetar snabbt för att minska den tid cellerna hålls utanför inkubatorn.

V…

Materials

Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	The curved end facilitates removal of the cerebellum
Micro-dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS solution	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coat coverslips 1 day before use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Mouse anti-ED1 antibody	Abcam	ab31630