بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
وقد تقدمت هندسة الأنسجة القلبية إلى حد كبير في العقد الماضي، مع مجموعات متعددة نشر نتائج وظيفية بالكامل، والضرب الأنسجة المصنوعة من كلا العضلية الفئران 1-6، وفي الآونة الأخيرة، myocytes القلب الإنسان المستمدة الخلايا الجذعية 7-12. إن مجال هندسة الأنسجة القلبية من قبل اثنين من الأهداف الرئيسية والمستقلة أساسا: 1) لتطوير ترقيع الخارجية التي يمكن زرعها في قلوب فشلها في تحسين وظيفة 4-6. و2) لتطوير نماذج في المختبر لدراسة علم وظائف الأعضاء والمرض، أو أدوات الفحص للتنمية العلاجية 2،7.
يعتبر ثلاثي الأبعاد (3-D) زراعة الخلايا ضرورية لتطوير أدوات الفحص الجيل القادم، كما تعكس المصفوفة 3-D المكروية القلب أكثر طبيعية من ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية 2-D. في الواقع بعض جوانب بيولوجيا الخلية تختلف اختلافا جوهريا في 2-D الثقافات مقابل 3-D 13،14 </suص>. بالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء أنسجة القلب هندسيا من عناصر محددة تماما: المصفوفة خارج الخلية، ويبلغ عدد سكانها الخلية. لأنسجة القلب عند الإنسان التقليدية، بينما يتم التحكم في تكوين مصفوفة خارج الخلية (عادة الفيبرين 9 أو الكولاجين 7،8،10) بدقة، يتم تعريف تكوين خلية مدخلات أقل بشكل جيد، مع خليط كامل من الخلايا من تمايز القلب موجهة إما الخلايا الجذعية الجنينية (ESC 7،9) أو التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (IPSC 10،12) يتم إضافتها إلى الأنسجة. اعتمادا على خط خلية معينة وكفاءة بروتوكول التمايز المستخدمة، ونسبة الناتج العضلية يمكن أن تتراوح بين أقل من 25٪ إلى أكثر من 90٪، والنمط الظاهري cardiomyocyte محددة (على سبيل المثال، ventricular-، atrial-، أو تنظيم ضربات القلب مثل) يمكن أيضا تختلف، حتى جزء غير cardiomyocyte يمكن أن تكون متباينة للغاية 15،16 ويغير نضج م القلب متباينةyocytes 17.
وقد حاولت مؤخرا القلب عمل هندسة الأنسجة للسيطرة على السكان المدخلات من الخلايا، إما مع مراسل القلب الجذعية الجنينية البشرية خط الخلية 8 أو خلية السطح علامات 18 تستخدم لعزل المكون العضلية القلبية من التمايز. بينما في البداية الأنسجة المكونة من myocytes القلب الوحيدة التي يبدو أن المثل الأعلى، وهذا هو في الواقع ليس كذلك. فشل hECTs تتألف فقط من myocytes القلب ضغط إلى أنسجة وظيفية، مع بعض الجماعات كشفت عن نسبة 3: 1 من myocytes القلب: الخلايا الليفية المنتجة أعلى قوة نشل 8. باستخدام مختلف أساليب تحديد الخلية، بما في ذلك علامات سطح لفرز الخلايا الحية، فمن الممكن لخلق hECTs مع السكان الخلية المحددة. بينما علامات خلايا انسجة غير القلب كانت متاحة لبعض الوقت، مثل علامة الليفية المفترضة CD90 19،20، كانت علامات سطح myocytes القلب أكثر صعوبةالتعرف عليها. كان SIRPα من بين أولى علامات سطح القلب التي تم تحديدها لmyocytes القلب الإنسان 18 ولقد ثبت أن تكون انتقائية للغاية لنسب القلب. مؤخرا، وجدنا أن مزدوجة والفرز لSIRPα + وCD90 – الخلايا العضلية ينتج نقية تقريبا، مع CD90 + سكان واظهار مثل الخلايا الليفية النمط الظاهري (Josowitz والملاحظات غير منشورة). وبناء على هذه النتائج التي تم جمعها، هنا وصفنا خلق hECTs باستخدام 3: مجموعة 1 من SIRPα + / CD90 – العضلية وCD90 + الخلايا الليفية.
القدرة على هندسة الأنسجة القلبية الإنسان يعرف تماما أمر ضروري ليس فقط لخلق أدوات الفحص قوية، ولكن أيضا لتطوير نظم نموذج للتحقيق الخلوي الناشئة وعلاجات القلب على أساس الجينات. وعلى وجه الخصوص، والعديد من علاجات الخلايا لقصور القلب، وذلك باستخدام أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الجذعية الوسيطة (MSC) 21 </سوب>، الخلايا الجذعية القلب 22 والخلايا وحيدة النواة نخاع العظام 23-25، قد تم اختبارها في التجارب السريرية. في حين أن العديد من النتائج الأولية قد وعد 21،23،25، والاستفادة الأولية غالبا ما يقلل مرور الوقت 26-29. تم الإبلاغ عن وجود اتجاه مماثل في الفئران المهندسة أنسجة القلب، الذي عرض فائدة وظيفية كبيرة بسبب MSC مكملات، ولكن لم تتم المحافظة صالح خلال ثقافة طويل الأجل 1. الكامنة وراء الأداء دون المستوى الأمثل هو معرفتنا محدودة من الآليات التي تحكم علاجات الخلايا. فهم أعمق لكيفية الخلايا العلاجية ممارسة تأثير مفيد، وكذلك العواقب السلبية المحتملة من التفاعلات العضلية nonmyocyte، سيمكن تطوير وتحسين العلاجات تحقق فوائد هامة سريريا ومستدامة، مع آثار جانبية أقل، للمرضى المصابين بقصور في القلب.
هنا، نحن تصف استخدام hECTs محددة لinterrogأكل آليات العلاج المبني على الخلية. تكوين الأنسجة التي تسيطر عليها أمر ضروري لتحديد العوامل المحددة التي تؤثر على أداء cardiomyocyte. المكمل مباشرة hECTs مع نوع من الخلايا العلاجية من الفائدة (على سبيل المثال، اللجان الدائمة)، يمكن أن تكشف عن الآثار المترتبة على أداء العضلية القلبية، ولقد أثبتنا في النظام الأوروبي الفئران 1.
يبدأ بعد بروتوكول متعددة الخطوات مع توجه القلب تمايز الخلايا الجذعية، تليها تصنيع مفاعل حيوي متعدد الأنسجة، وعقد مع وصفا لبناء الأنسجة والتحليل الوظيفي. يتم تنفيذ تجاربنا باستخدام سطر وافق NIH-H7 الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC). ومع ذلك، كما تم اختبار البروتوكولات التالية باستخدام خط HESC إضافية وثلاثة الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط مع نتائج مماثلة. لقد وجدنا أن الكفاءة في تمايز cardiomyocyte والنجاح في كان الحاخام هيشت تلفيق يمكن أن يكون خط الخلية التابعة، لا سيما FOخطوط ص hiPSC المستمدة من مريض على حدة. باتباع هذا البروتوكول، ومطلي طبقين 6 جيدا مع ما مجموعه 1680000 hESCs (140،000 الخلايا لكل بئر)، والتي ينتج ما يقرب من 2.5 مليون myocytes بعد التفريق لمدة 20 أيام والفرز، وهو ما يكفي لجعل ستة الأنسجة محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بناء الأنسجة تعريف الإنسان المهندسة القلب (كان الحاخام هيشت) يمكن أن تقدم نموذجا أكثر اتساقا وموثوق بها وظيفة العضلية القلبية الإنسان. الأهم من ذلك، جميع المكونات الخلوية وخارج الخلية في نظام معروفة ويمكن التلاعب بها كما هو مطلوب، وبالتالي إزالة تأثير الخلط من أنوا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1F30HL118923-01A1) إلى TJC، المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI PEN عقد HHSN268201000045C إلى KDC، المجلس منحة بحثية من هونغ كونغ TRS T13-706 / 11 (KDC)، المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL113499) إلى BDG، أمريكا جمعية القلب (12PRE12060254) إلى الملكية الأردنية، ومجلس منحة بحثية من هونج كونج (TBRS، T13-706 / 11) وقدم إلى RL تمويل إضافي لTJC من المعاهد الوطنية للصحة DRB 5T32GM008553-18 ونتيجة لتدريب على التدريب NIDCR متعدد التخصصات في أنظمة والتنموية علم الأحياء والعيوب الخلقية T32HD075735. يرغب المؤلفون أيضا عن تقديره وامتنانه آرثر Autz في مركز زان من كلية مدينة نيويورك للحصول على المساعدة مع بالقطع مفاعل حيوي وممدوح الدالى للحصول على المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور كينيث Boheler لتقديم المشورة بشأن التمايز القلب، والدكتور جوشوا هير لتوفير بسخاء الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
- Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
- Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
- Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial–a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
- Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
- Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
- Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
- Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
