Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

L' ingénierie tissulaire cardiaque a beaucoup progressé dans la dernière décennie, avec plusieurs groupes d' édition de résultats, les tissus entièrement fonctionnels en battant fabriqués à partir de deux cardiomyocytes murins ^1-6 et, plus récemment, les myocytes cardiaques de cellules souches dérivées humaines ^7-12. Le domaine de l' ingénierie du tissu cardiaque est entraîné par deux objectifs principaux et essentiellement indépendants: 1) pour développer des greffes exogènes qui peuvent être transplantées dans des cœurs défaillants pour améliorer la fonction ^4-6; et 2) pour développer des modèles in vitro pour étudier la physiologie et de la maladie, ou comme outils de dépistage pour le développement thérapeutique ^2,7.

Dimensions Trois (3-D) culture cellulaire est considérée comme essentielle pour le développement d'outils de dépistage de la prochaine génération, comme la matrice 3-D reflète un microenvironnement cardiaque plus naturel que la culture traditionnelle 2-D cellulaire monocouche; En effet , certains aspects de la biologie cellulaire sont fondamentalement différents en 2-D cultures par rapport à 3-D ^13,14 </sup>. En outre, les tissus cardiaques modifiés sont construits à partir de composants complètement définies: une matrice extracellulaire et d'une population cellulaire. Pour les tissus cardiaques humains génétiquement traditionnels, tandis que la composition de la matrice extracellulaire (habituellement fibrine ou collagène ^{9 7,8,10)} est strictement contrôlée, la composition de la cellule d'entrée est moins bien définie, avec l'ensemble du mélange de cellules à partir d' une différenciation cardiaque dirigée soit les cellules souches embryonnaires (ESC ^7,9) ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP ^10,12) étant ajoutés aux tissus. En fonction de la lignée cellulaire spécifique et l'efficacité du protocole de différenciation utilisé, le pourcentage résultant de cardiomyocytes peut varier de moins de 25% à plus de 90%, le phénotype des cardiomyocytes spécifique (c. -à ventricular-, atrial- ou pacemaker) peut également varier, même la fraction non-cardiomyocytes peut être très hétérogène ^15,16 et de modifier la maturité du m cardiaque différenciéyocytes ^17.

Récentes cardiaque travaux de génie tissulaire a tenté de contrôler la population d'entrée des cellules, soit avec une surface les marqueurs ¹⁸ reporter cardiaque lignée de cellules souches embryonnaires humaines ⁸ ou de la cellule utilisée pour isoler la composante de myocytes cardiaques de la différenciation. Bien qu'initialement un tissu composé de seulement myocytes cardiaques semble être l'idéal, cela est en fait pas le cas; hECTs composés uniquement de myocytes cardiaques ne parviennent pas à compacter dans des tissus fonctionnels, avec certains groupes de trouver un rapport de 3: 1 des myocytes cardiaques: fibroblastes produisant la force de contraction le plus élevé ^8. En utilisant différents procédés de sélection de cellules, y compris les marqueurs de surface pour le tri des cellules vivantes, il est possible de créer hECTs avec des populations cellulaires définies. Tandis que les marqueurs de cellules stromales non cardiaques sont disponibles depuis un certain temps, tels que le marqueur CD90 des fibroblastes putatif ^19,20, les marqueurs de surface des myocytes cardiaques ont été plus difficilespour identifier. SIRPα a été parmi les premiers marqueurs de surface cardiaques identifiés pour les cardiomyocytes humains ¹⁸ et il a été montré très sélectif pour la lignée cardiaque. Récemment, nous avons constaté que double tri pour SIRPα ⁺ et CD90 ^– cellules cardiomyocytes rendements presque purs, avec le CD90 ⁺ population présentant un phénotype de type fibroblaste (Josowitz, observations non publiées). Sur la base de ces constatations recueillies, nous décrivons ici la création d' hECTs en utilisant un 3: 1 combinaison de SIRPα ⁺ / CD90 ^– cardiomyocytes et CD90 ⁺ fibroblastes.

La capacité à concevoir un tissu cardiaque humain complètement défini est essentiel non seulement pour créer des outils de dépistage robustes, mais aussi pour le développement de systèmes modèles pour étudier émergents cellules et thérapies cardiaques géniques. En particulier, de nombreuses thérapies cellulaires pour l' insuffisance cardiaque, en utilisant des types de cellules incluant des cellules souches mésenchymateuses (MSC) ²¹ </sup>, les cellules souches cardiaques ²² et les cellules mononucléaires de la moelle osseuse ^23-25 ​​ont été testés dans des essais cliniques. Bien que plusieurs des premiers résultats ont été prometteurs ^21,23,25, la prestation initiale diminue souvent au fil du temps ^26-29. Une tendance similaire a été rapportée dans murins d' ingénierie des tissus cardiaques, qui présentent un avantage fonctionnel important en raison de MSC supplémentation, mais l'avantage ne ​​soit pas soutenue pendant la culture à long terme ^1. Sous-jacent la performance sous-optimale est notre connaissance limitée des mécanismes régissant les thérapies cellulaires. Une meilleure compréhension de la façon dont les cellules thérapeutiques exercer leur influence bénéfique, ainsi que les conséquences négatives potentielles des interactions myocytes-nonmyocyte, permettrait le développement de thérapies améliorées qui donne des avantages cliniquement significatifs et durables, avec des effets secondaires minimes, pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque.

Ici, nous décrivons l'utilisation de hECTs définies à interrogate mécanismes de thérapie cellulaire. La composition tissulaire contrôlé est essentiel d'identifier les facteurs spécifiques qui influent les performances des cardiomyocytes. Directement complétant hECTs avec le type de cellules d'intérêt thérapeutique (par exemple, MSCs), peut révéler les effets sur la performance cardiaque de myocytes, comme nous l' avons démontré dans ECTs de rat ^1.

Le protocole en plusieurs étapes suivant commence par la différenciation des cellules souches cardiaques dirigée, suivie par la fabrication du bioréacteur multi-tissulaire, et se terminant par une description de la construction de tissu et l'analyse fonctionnelle. Nos expériences sont effectuées en utilisant la ligne H7 NIH approuvé les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Cependant, les protocoles suivants ont également été testés en utilisant une lignée de CSEh supplémentaire et trois induite cellules souches pluripotentes (hiPSC) lignes avec des résultats similaires. Nous avons constaté que l'efficacité dans la différenciation des cardiomyocytes et de succès dans la fabrication HECT peut être lignée cellulaire dépendante, en particulier for lignes hiPSC dérivées de patients individuels. En suivant ce protocole, deux plats de 6 puits sont plaquées avec un total de 1,68 millions de CSEh (140.000 cellules par puits), ce qui donne environ 2,5 millions de myocytes après différenciation pendant 20 jours et le tri, assez pour faire six tissus définis.

Protocol

Remarque: Effectuez toutes les manipulations de cellules dans des conditions aseptiques en utilisant une classe II enceinte de sécurité biologique de filtre HEPA et stériliser toutes les solutions en les filtrant à travers un filtre de 0,2 um. Effectuer la construction des tissus et des tests de fonction soit dans les mêmes conditions aseptiques ou une hotte à flux laminaire. 1. Ensemencement des H7 CSEh dans la préparation pour Différenciation cardiaque (Jour 1) Préparat…

Representative Results

Pour obtenir les myocytes cardiaques, une version légèrement modifiée des méthodes de différenciation Boheler et Lian est utilisé 30,31. Il est impératif que la différenciation commence au cours de la phase logarithmique de la croissance cellulaire, mais aussi que la population de départ est suffisamment confluentes pour obtenir un nombre utilisable de cellules après tri (environ 75% est optimal). Typiquement, pour H7 CSEh, placage à une densité de 140.000 CSEh par puits d'un plat à 6 puits d…

Discussion

La construction de tissus humains définis par génie cardiaque (HECT) peut fournir un modèle plus cohérent et fiable de la fonction cardiaque humaine myocytes. Critique, tous les composants cellulaires et extracellulaires dans le système sont connus et peuvent être manipulées comme désiré, en éliminant ainsi l'influence des facteurs de confusion d'autres types cellulaires inconnus résultant du processus de différenciation. Pour équilibrer la croissance cellulaire rapide et un rendement élevé, il es…

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors