Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
Cardiac Tissue Engineering hat in den letzten zehn Jahren mit mehreren Gruppen Veröffentlichung der Ergebnisse der voll funktionsfähig, schlagen Gewebe aus beiden murine Kardiomyozyten 1-6 und in jüngster Zeit , die menschliche Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen 7-12 stark vorangetrieben . Das Herzgewebe Engineering – Bereich wird von zwei primären und im wesentlichen unabhängig Ziele angetrieben: 1) exogene Transplantate zu entwickeln , die in Ermangelung Herzen transplantiert werden kann , um die Funktion zu verbessern 4-6; und 2) In – vitro – Modelle zu entwickeln , für das Studium der Physiologie und Krankheit, oder als Screening – Tools für die therapeutische Entwicklung 2,7.
Dreidimensionale (3-D) Zellkultur als Basis für das nächste Generation Screening-Tools zu entwickeln, wie die 3-D-Matrix eine natürliche Herzmikroumgebung als herkömmliche 2-D-Monolayer-Zellkultur widerspiegelt; in der Tat sind einige Aspekte der Zellbiologie grundverschieden in 2-D vs. 3-D Kulturen 13,14 </sup>. Zusätzlich sind so konstruiert Herzgewebe von vollständig definierten Komponenten aufgebaut: einer extrazellulären Matrix und einer Zellpopulation. Für traditionelle engineered menschlichen Herzgewebe, während die extrazelluläre Matrix – Zusammensetzung ( in der Regel Fibrin 9 oder Kollagen 7,8,10) streng kontrolliert wird , wird die Eingangszelle Zusammensetzung weniger gut definiert, mit der gesamten Mischung von Zellen aus einer gerichteten Herzdifferenzierung entweder embryonale Stammzellen (ESC 7,9) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS 10,12) zu den Geweben aufgenommen werden. Abhängig von der spezifischen Zelllinie und die Effizienz der Differenzierung Protokoll verwendet, kann der resultierende Prozentsatz der Kardiomyozyten reichen von weniger als 25% auf über 90%, die spezifische cardiomyocyte Phänotyp (dh ventricular-, atrial- oder Schrittmacher-like) kann auch variieren, auch die nicht-Kardiomyozyten Fraktion 15,16 und verändern die Reife des differenzierten Herz m sehr heterogen seinyocytes 17.
Aktuelle Herzgewebe Engineering – Arbeiten wurde versucht , die Eingangs Population von Zellen zu steuern, entweder mit einem Herz-Reporter humanen embryonalen Stammzelllinie 8 oder Zelloberflächenmarker 18 verwendet wird , um die Kardiomyozyten – Komponente der Differenzierung zu isolieren. Während zunächst ein Gewebe von nur Kardiomyozyten bestehen würde die ideal zu sein scheinen, ist dies in der Tat nicht der Fall; zusammengesetzt hECTs nicht nur aus Kardiomyozyten in funktionelle Gewebe zu verdichten, wobei einige Gruppen ein 3 zu finden: 1 – Verhältnis von Kardiomyozyten: Fibroblasten 8 die höchste Zuckungskraftmessungen erzeugen. verschiedene Zellselektionsmethoden, einschließlich Oberflächenmarker für lebende Zellsortierung durch Verwendung ist es möglich, hECTs mit definierten Zellpopulationen zu schaffen. Während der Marker nicht-kardialen Stromazellen seit einiger Zeit zur Verfügung haben, wie beispielsweise die putative Fibroblasten – Marker CD90 19,20, Oberflächenmarker von kardialen Myozyten waren schwierigerzu identifizieren. SIRPα gehörte zu den ersten Marker Herzoberfläche für den menschlichen Kardiomyozyten identifiziert 18 und wurde für die Herz-Linie sehr selektiv erwiesen. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass zwei Sortieranlage für SIRPα + und CD90 – -Zellen nahezu reinen Kardiomyozyten mit der CD90 + -Population ergibt einen Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp (Josowitz, nicht veröffentlichte Beobachtungen) aufweist. Auf der Basis dieser gesammelten Erkenntnisse, berichten hier schaffen wir hECTs unter Verwendung eines 3: 1 – Kombination von SIRPα + / CD90 – Kardiomyozyten und CD90 + Fibroblasten.
Die Fähigkeit, eine vollständig definierte menschliche Herzgewebe zu konstruieren ist nicht nur für robuste Screening-Tools zu schaffen, sondern auch für die Entwicklung von Modellsystemen Schwellen zell- und Gen-basierten Herztherapien zu untersuchen. Insbesondere zahlreiche Zelltherapien für Herzversagen, unter Verwendung von Zelltypen , einschließlich mesenchymalen Stammzellen (MSC) 21 </sup>, Herz-Stammzellen 22 und Knochenmark mononukleären Zellen 23-25, wurden in klinischen Studien getestet. Während viele der ersten Ergebnisse haben 21,23,25 waren vielversprechend, verringert sich die anfängliche Nutzen oft im Laufe der Zeit von 26 bis 29. Ein ähnlicher Trend wurde in murine engineered Herzgewebe berichtet worden, die durch MSC – Supplementierung einen signifikanten funktionellen Nutzen anzuzeigen, der Vorteil wird jedoch nicht während einer Langzeitkultur 1 aufrechterhalten. die suboptimale Leistung Basiswert ist unser begrenztes Wissen über die Mechanismen, Zelltherapien regeln. Ein tieferes Verständnis davon, wie therapeutischen Zellen ihre positiven Einfluss ausüben, sowie mögliche negative Auswirkungen von myocyte-nonmyocyte Wechselwirkungen, würde die Entwicklung verbesserter Therapien ermöglichen klinisch signifikante und anhaltende Vorteile, mit minimalen Nebenwirkungen bei Patienten mit Herzinsuffizienz führt.
Hier beschreiben wir die Verwendung von definierten hECTs zu interrogate Mechanismen der zellbasierte Therapie. Die gesteuerte Gewebezusammensetzung ist wichtig, spezifische Faktoren zu identifizieren, Kardiomyozyten Leistung zu beeinträchtigen. Direkt hECTs mit dem therapeutischen Zelltyp von Interesse (zB MSCs) ergänzt werden , können die Auswirkungen auf die Kardiomyozyten – Leistung zeigen, wie wir in der Ratte ECTs 1 unter Beweis gestellt haben.
Die folgenden Mehrschritt-Protokoll beginnt mit gerichtetem kardiale Stammzelldifferenzierung, gefolgt von der Herstellung des Mehr Gewebe-Bioreaktor, und mit einer Beschreibung der Gewebekonstruktion und funktionelle Analyse abzuschließen. Unsere Experimente ausgeführt, um die NIH-zugelassenen H7 mit humanen embryonalen Stammzellen (hES) Zeile. Allerdings haben die folgenden Protokolle auch eine zusätzliche hESC Linie und drei induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien mit ähnlichen Ergebnissen getestet werden. Wir haben herausgefunden, dass die Effizienz in Kardiomyozytendifferenzierung und Erfolg in Hect Herstellungszelllinie abhängig sein kann, vor allem for hiPSC Linien von einzelnen Patienten abgeleitet. Durch Anschluss an dieses Protokoll, zwei 6-Well-Platten sind mit insgesamt 1,68 Millionen hESCs (140.000 Zellen pro Vertiefung) plattiert, die etwa 2,5 Millionen Myozyten nach Differenzierung für 20 Tage ergibt und Sortieren, genug sechs definierte Gewebe zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Bau der definierten menschlichen engineered Herzgewebe (Hect) können bieten eine konsistente und zuverlässige Modell der menschlichen Kardiomyozyten-Funktion. Critically alle zellulären und extrazellulären Komponenten im System sind bekannt und können nach Wunsch manipuliert werden, wodurch die confounding Einfluss anderer Zelltypen unbekannten Entfernung von dem Differenzierungsprozess resultieren. Um einen schnellen Zellwachstum und hohe Ausbeute auszubalancieren, ist es bevorzugt, dass die Differenzierung be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH (1F30HL118923-01A1) zu TJC, NIH / NHLBI PEN Vertrag HHSN268201000045C auf KDC, das Forschungsstipendium Rat von Hong Kong TRS T13-706 / 11 unterstützt (KDC), NIH (R01 HL113499) zu BDG, die amerikanische heart Association (12PRE12060254) zu RJ und Research Grant Council of HKSAR (TBR, T13-706 / 11) zusätzliche Mittel zu RL wurde TJC von NIH DRB 5T32GM008553-18 zur Verfügung gestellt und als Praktikum auf NIDCR-Interdisziplinäre Ausbildung in Systeme und Entwicklungs Biologie und Geburtsfehler T32HD075735. Die Autoren möchten auch dankbar Arthur Autz an der Zahn Zentrum der City College of New York für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Bioreaktors und Mamdouh Eldaly für die technische Unterstützung anerkennen. Wir danken auch Dr. Kenneth Boheler für die Beratung über Herz-Differenzierung und Dr. Joshua Hare für humanen mesenchymalen Stammzellen großzügig bereitstellt.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
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