Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

Ingeniería de tejido cardiaco ha avanzado considerablemente en la última década, con múltiples grupos editoriales resultados de tejidos totalmente funcionales, superando confeccionada con cardiomiocitos murinos ^1-6 y, más recientemente, los miocitos cardíacos derivados de células madre humanas ^7-12. El campo de la ingeniería de tejido cardiaco se debe a dos objetivos primarios y esencialmente independientes entre sí: 1) para desarrollar injertos exógenos que pueden trasplantarse en su defecto corazones para mejorar la función ^4-6; y 2) el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de la fisiología y la enfermedad, o como instrumentos de evaluación para el desarrollo terapéutico ^2,7.

Tridimensional (3-D) de cultivo celular se considera esencial para el desarrollo de herramientas de detección de próxima generación, como la matriz 3-D refleja un microambiente cardiaca más natural que la cultura tradicional monocapa de células 2-D; de hecho, algunos aspectos de la biología celular son fundamentalmente diferentes en 2-D culturas vs. 3-D ^13,14 </sup>. Además, los tejidos cardíacos ingeniería se construyen a partir de componentes completamente definidas: una matriz extracelular, y una población de células. Para los tejidos cardíacos humanos de ingeniería tradicionales, mientras que la composición de la matriz extracelular (por lo general de fibrina o colágeno ^{9 7,8,10)} está estrictamente controlada, la composición celda de entrada no está bien definido, con toda la mezcla de células a partir de una diferenciación cardiaca dirigido de cualquiera células madre embrionarias (ESC ^7,9) o células madre pluripotentes inducidas (IPSC ^10,12) que se añaden a los tejidos. Dependiendo de la línea celular específica y la eficiencia del protocolo de diferenciación se utiliza, el porcentaje resultante de los cardiomiocitos puede variar desde menos de 25% a más del 90%, el fenotipo de cardiomiocitos específico (es decir, ventricular-, atrial-, o similar al marcapasos) también puede variar, aunque la fracción no cardiomiocitos puede ser muy heterogéneo ^15,16 y alterar la madurez de la m cardiaca diferenciadayocytes ^17.

Recientes trabajos de ingeniería de tejido cardiaco ha intentado controlar la población de entrada de las células, ya sea con una superficie de la línea de células madre embrionarias humanas reportero cardiaca ⁸ o ¹⁸ células marcadores se utiliza para aislar el componente de los cardiomiocitos de la diferenciación. Aunque en un principio un tejido compuesto de sólo miocitos cardíacos parece ser el ideal, esto es, de hecho, no es el caso; hECTs compuestas únicamente de los miocitos cardíacos no pueden compactar en tejidos funcionales, con algunos grupos encontrar una relación 3: 1 de los miocitos cardíacos: fibroblastos producir la más alta fuerza de contracción ^8. Mediante el uso de diferentes métodos de selección de células, incluyendo marcadores de la superficie para la clasificación de células en vivo, es posible crear hECTs con poblaciones de células definidas. Mientras que los marcadores de las células del estroma no cardíacas han estado disponibles durante algún tiempo, tal como el marcador de fibroblastos putativo CD90 ^19,20, marcadores de superficie de los miocitos cardíacos han sido más difícilesidentificar. SIRPα estaba entre los primeros marcadores de superficie cardíacos identificados para los miocitos cardiacos humanos ¹⁸ y se ha demostrado ser altamente selectivo para el linaje cardiaco. Recientemente, hemos encontrado que la doble clasificación para SIRPα ⁺ y CD90 ^– células rendimientos cardiomiocitos casi puros, con el CD90 ⁺ de la población que presenta un fenotipo similar a fibroblastos (Josowitz, observaciones no publicadas). Sobre la base de estos hallazgos recogidos, Aquí se describe la creación de hECTs utilizando una mezcla 3: 1 de combinación SIRPα ⁺ / CD90 ^– cardiomiocitos y fibroblastos CD90 ^+.

La capacidad de diseñar un tejido cardiaco humano completamente definido es esencial no sólo para la creación de herramientas de detección sólidas, sino también para el desarrollo de sistemas modelo para investigar por células emergentes y las terapias basadas en genes cardiacos. En particular, numerosas terapias con células para la insuficiencia cardíaca, utilizando tipos de células incluyendo las células madre mesenquimales (MSC) ²¹ </sup>, las células madre cardiacas ²² y las células mononucleares de médula ósea ^23-25, se han probado en ensayos clínicos. Mientras que muchos de los resultados iniciales han sido prometedores ^21,23,25, el beneficio inicial con frecuencia disminuye con el tiempo ^26-29. Una tendencia similar se ha reportado en los tejidos cardiacos murinos ingeniería, que muestran un beneficio funcional significativa debido a la suplementación MSC, pero el beneficio no se mantiene durante el cultivo a largo plazo ^1. Subyace el rendimiento subóptimo es nuestro conocimiento limitado de los mecanismos que regulan las terapias celulares. Una comprensión más profunda de cómo las células terapéutica ejercer su influencia beneficiosa, así como las posibles consecuencias negativas de las interacciones de los miocitos-nonmyocyte, permitiría el desarrollo de mejores terapias produciendo beneficios clínicamente significativos y sostenidos, con efectos secundarios mínimos, para los pacientes con insuficiencia cardíaca.

A continuación, describimos el uso de hECTs definidos para interrogcomió mecanismos de terapia basada en células. La composición del tejido controlada es esencial para identificar los factores específicos que afectan el rendimiento de los cardiomiocitos. Directamente complementar hECTs con el tipo de célula terapéutico de interés (por ejemplo, MSC), puede revelar los efectos sobre el rendimiento de miocitos cardiacos, como hemos demostrado en el ECTS rata ^1.

El siguiente protocolo multi-paso comienza con la diferenciación de células madre cardiaca dirigida, seguido por la fabricación del biorreactor multi-tejido, y concluyendo con una descripción de la construcción de tejidos y análisis funcional. Nuestros experimentos se realizaron con la línea de células madre de embriones humanos aprobados por el NIH H7 (células madre). Sin embargo, los siguientes protocolos también se han probado utilizando una línea de células madre adicionales y tres líneas de célula madre pluripotente inducida (hiPSC) con resultados similares. Hemos encontrado que la eficiencia en la diferenciación de los cardiomiocitos y el éxito en Hect fabricación puede ser línea celular dependiente, particularmente folíneas r hiPSC derivadas de pacientes individuales. Siguiendo este protocolo, dos placas de 6 pocillos se sembraron con un total de 1,68 millones de hESCs (140.000 células por pocillo), que produce aproximadamente 2,5 millones de miocitos después de la diferenciación durante 20 días y clasificación, lo suficiente como para hacer seis tejidos definidos.

Protocol

Nota: Realice todas las manipulaciones celulares en condiciones asépticas utilizando una cabina de seguridad biológica con filtro HEPA de clase II y esterilizar todas las soluciones filtrando a través de un filtro de 0,2 micras. Realizar creación de tejidos y pruebas de función, ya sea en las mismas condiciones asépticas o una campana de flujo laminar. 1. Siembra de hESCs H7 en preparación para la diferenciación cardiaca (Día 1) Preparación de la membrana basal para la m…

Representative Results

Para obtener los miocitos cardíacos, una versión ligeramente modificada de los métodos de diferenciación Boheler y Lian se utiliza 30,31. Es imperativo que la diferenciación se inicia durante el registro de la fase de crecimiento celular, sino también que la población inicial es suficientemente confluente para obtener un número utilizable de las células después de la clasificación (aproximadamente 75% es óptimo). Típicamente, para H7 hESCs, placas a una densidad de 140.000 hESCs por pocillo de un…

Discussion

Construcción de tejidos humanos definidos por ingeniería cardíacas (hect) puede proporcionar un modelo más consistente y fiable de la función de los cardiomiocitos humanos. Fundamentalmente, todos los componentes celulares y extracelulares en el sistema son conocidos y se pueden manipular como se desee, eliminando así la influencia de confusión de otros tipos de células desconocidos que resultan del proceso de diferenciación. Para equilibrar el crecimiento celular rápido y de alto rendimiento, es preferible qu…

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors