Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
Инженерные ткани сердца значительно продвинулся вперед в последнее десятилетие, с несколькими группами , публикующих результаты полностью функциональных, избивая тканей , изготовленных из обеих мышиных кардиомиоцитов 1-6 и, совсем недавно, стволовых клеток , полученных из человеческих кардиомиоцитов 7-12. Тканевой инженерии поле сердца приводится в движение двумя первичными и , по существу независимых целей: 1) разработать экзогенные трансплантаты , которые могут быть пересажены в отсутствии сердца , чтобы улучшить функцию 4-6; и 2) разработать в моделях пробирке для изучения физиологии и болезни, или как инструменты скрининга для терапевтического развития 2,7.
Трехмерная (3-D) для культивирования клеток считается необходимым для разработки скрининговых инструментов нового поколения, так как 3-D матрица отражает более естественный сердечный микросреду, чем традиционная 2-D культуре клеток монослоя; на самом деле некоторые аспекты клеточной биологии существенно отличаются в 2-D по сравнению с 3-D культур 13,14 </suр>. Кроме того, сконструированные сердечной ткани изготовлены из полностью определенных компонентов: внеклеточного матрикса и клеточной популяции. Для традиционных сконструированных сердечной ткани человека, в то время как внеклеточный состав матрицы (обычно фибрин 9 или коллаген 7,8,10) строго контролируется, состав входной ячейки менее выражены, со всей смеси клеток из организма, направленной сердечной дифференциации либо эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или 7,9 индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSC 10,12) добавляется к тканям. В зависимости от конкретной клеточной линии и эффективности протокола дифференцировки , используемой, в результате процент кардиомиоцитов может находиться в диапазоне от менее 25% до более чем 90%, специфический для кардиомиоцитов фенотип (т.е. ventricular-, atrial-, или водитель ритма типа) может также варьироваться, даже не-кардиомиоциты фракция может быть весьма неоднородны 15,16 и изменять зрелость дифференцированного сердца мyocytes 17.
Последние тканевой инженерии работы сердца была предпринята попытка контролировать входную популяцию клеток, либо с сердечным репортер человеческих эмбриональных стволовых клеток линии 8 или маркеров клеточной поверхности 18 используется для изоляции сердца миоцитов компонент дифференциации. Хотя первоначально ткань состоит только из кардиомиоцитов, казалось бы идеальным, это на самом деле не так; hECTs , состоящие только из кардиомиоцитов не уплотнять в функциональные ткани, при этом некоторые группы найти соотношение 3: 1 кардиомиоцитов: фибробласты , продуцирующие самую высокую дергаться силу 8. Используя различные методы отбора клеток, в том числе поверхностных маркеров для сортировки живых клеток, то можно создать hECTs с определенными клеточными популяциями. В то время как маркеры несердечных стромальных клеток были доступны в течение некоторого времени, например, предположительной фибробластами маркера CD90 19,20, поверхностных маркеров кардиомиоцитов было труднееидентифицировать. SIRPα была среди первых сердечных поверхностных маркеров , идентифицированных для кардиомиоцитов человека 18 , и было показано, что высоко селективным для сердечной линии. В последнее время мы обнаружили , что двойные сортировки для SIRPα + и CD90 – клеток дает почти чистый кардиомиоциты, с CD90 + популяции , проявляющего фибробласта-фенотип (Josowitz, неопубликованные наблюдения). На основе этих собранных результатов, в настоящем документе мы описываем создание hECTs с использованием 3: 1 из комбинации SIRPα + / CD90 – кардиомиоциты и CD90 + фибробласты.
Способность спроектировать полностью определенную сердечную ткань человека имеет важное значение не только для создания надежных инструментов скрининга, но и для разработки модельных систем для изучения возникающих сотовом и генные на основе сердечной терапии. В частности, многочисленные методы лечения клеточных по поводу сердечной недостаточности, с использованием типов клеток , включая мезенхимальных стволовых клеток (МСК) 21 </SUP>, сердечные стволовые клетки 22 и костного мозга мононуклеары 23-25 были протестированы в клинических испытаниях. В то время как многие из первоначальных результатов были многообещающими 21,23,25, первоначальная выгода часто уменьшается с течением времени 26-29. Аналогичная тенденция сообщается в мышиных инженерии сердечной ткани, которые показывают значительное функциональное преимущество за счет MSC добавок, но положительный результат не сохраняется при длительной культуре 1. В основе суб-оптимальную производительность наше ограниченное знание механизмов, регулирующих клеточной терапии. Более глубокое понимание того, как терапевтическое клетки оказывают свое благотворное влияние, а также возможные негативные последствия миоцитов-nonmyocyte взаимодействий, будет способствовать разработке усовершенствованных методов лечения, дающую клинически значимые и устойчивые преимущества, с минимальными побочными эффектами, для пациентов с сердечной недостаточностью.
Здесь мы опишем использование определенных hECTs для interrogпоел механизмы клеточной терапии. Композиция с контролируемым ткани имеет важное значение для выявления конкретных факторов, влияющих производительность кардиомиоцитов. Непосредственно дополняя hECTs с терапевтическим типа клеток , представляющих интерес (например, MSCs), может выявить влияние на работу сердца миоцитов, как мы показали в крысиных ЕКТС 1.
Следующий протокол многоэтапным начинается с направленной сердца дифференцировки стволовых клеток, с последующим изготовлением биореакторе с участием многих тканей, и заканчивая описанием конструкции ткани и функционального анализа. Наши эксперименты выполняются с использованием линии NIH утвержденных H7 человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК). Тем не менее, следующие протоколы также были протестированы с использованием дополнительной линии чЭСК и три индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линии с аналогичными результатами. Мы обнаружили, что эффективность кардиомиоцитов дифференциации и успеха в производстве HECT может быть клеточная линия зависит, в частности, FOлинии г hiPSC, полученные из отдельных пациентов. Следуя этому протоколу, два 6-луночных планшетах высевают в общей сложности 1,68 млн ЭСК (140000 клеток на лунку), что дает примерно 2,5 млн миоциты после дифференциации в течение 20 дней и сортировки, достаточно, чтобы сделать шесть определенных тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Строительство определенных инженерных сердечных тканей человека (HECT) может обеспечить более последовательную и надежную модель человеческого сердца функции кардиомиоцитов. Чрезвычайно важно, все клеточные и внеклеточные компоненты системы, как известно, и ими можно манипулировать ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH (1F30HL118923-01A1) к ТСК, NIH / NHLBI PEN контракта HHSN268201000045C к KDC, исследование гранта совета Гонконга ТРС T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01) HL113499 к БДГ, американец Ассоциация сердца (12PRE12060254) к RJ, и научно-исследовательский совет Грант ОАРГ (TBRS, T13-706 / 11) RL Дополнительное финансирование было предоставлено ТСК по NIH DRB 5T32GM008553-18 и как стажировке на NIDCR-междисциплинарной подготовки кадров в области систем и связанных с развитием Биология и врожденным дефектам T32HD075735. Авторы также хотели бы с благодарностью признать Артура Autz в The Zahn центре города Колледж Нью-Йорка за помощь с обработкой биореактор и Mamdouh Eldaly об оказании технической помощи. Мы также благодарим доктора Кеннета Boheler за советом по сердечной дифференциации и доктор Джошуа Зайца за щедрое предоставление мезенхимальных стволовых клеток человека.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
- Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
- Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
- Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial–a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
- Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
- Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
- Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
- Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
