心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
心臓組織工学は、より最近になって、両方のマウス心筋1-6と、から作られた完全に機能する、鼓動組織、ヒト幹細胞由来の心筋細胞7-12の結果を公表する複数のグループで、10年間で大きく前進しました。心臓組織工学の分野は、二つの主要な本質的に独立した目標によって駆動される：1）機能4-6を改善することができない心臓に移植することができる外因性の移植片を開発します。及び2）生理学および疾患を研究するためのin vitroモデルの開発、または治療開発の2,7のためのスクリーニングツールとしてします。
三次元（3-D）細胞培養物を、3-Dマトリックスは、従来の2次元単層細胞培養物よりも自然な心臓の微小環境を反映するように、次世代のスクリーニングツールを開発するために必須であると考えられます。実際に細胞生物学のいくつかの側面は、2次元対3次元培養13,14根本的に異なっています</suP>。細胞外マトリックス、および細胞集団：さらに、操作心臓組織は完全に定義された成分から構成されています。細胞外マトリックス組成物（通常のフィブリン9またはコラーゲン7,8,10）を厳密に制御しつつ、従来の操作されたヒト心臓組織のために、入力細胞組成物は、あまりの指向心臓分化の細胞の混合物全体で、定義されますか胚性幹細胞（ESC 7,9）や人工多能性幹細胞（IPSC 10,12）を組織に添加されます。特定の細胞株および使用する分化プロトコルの効率に応じて、心筋の得率（ すなわち 、ventricular-、atrial-、またはペースメーカーのような）、25％未満から90％以上に、特定の心筋細胞表現型の範囲とすることができますまたしても、非心筋細胞画分は15,16非常に不均一であることで差別心臓メートルの成熟度を変更することができ、変化させることができます17を yocytes。
最近の心臓組織工学作業は心臓レポーターヒト胚性幹細胞株8または細胞表面マーカー18は、分化の心筋細胞成分を単離するために使用されるのいずれかで、細胞のインプット集団を制御しようとしています。唯一の心筋細胞で構成最初に組織が理想的であるように思われるが、これは実際にはそうではありません。心筋細胞の1：1の比率：線維芽細胞が最も高い単収縮力8を生成するのみ心筋細胞で構成hECTsは、いくつかのグループは、3を見つけることで、機能的な組織へと圧縮することができません。生細胞の選別のための表面マーカーを含む、様々な細胞の選択方法を用いることにより、定義された細胞集団でhECTsを作成することが可能です。非心臓マーカー間質細胞は、推定上の線維芽細胞マーカーCD90 19,20のように、しばらくの間利用可能であったが、心筋細胞の表面マーカーは、より困難でした特定する。 SIRPαは、人間の心筋細胞18のために同定された最初の心臓表面マーカー間にあったと心臓系統に高度に選択的であることが示されています。最近、我々は、SIRPα+およびCD90のための二重ソートことを発見した–細胞、線維芽細胞様の表現型（Josowitz、未発表の観察）を示すCD90 +集団と、ほぼ純粋な心筋細胞が得られます。心筋細胞およびCD90 +線維芽細胞– SIRPα+ / CD90の1組み合わせ：これらの収集した知見に基づき、本明細書中で我々は3を使用してhECTsを作成する方法を説明します。
完全に定義された人間の心臓組織を設計する能力は、堅牢なスクリーニングツールを作成するためだけでなく、新興の細胞および遺伝子に基づく心臓治療を研究するためのモデルシステムを開発するだけでなく、必要不可欠です。間葉系幹細胞（MSC）を含む細胞タイプを利用心不全、特に、多数の細胞療法、21 </SUP>、心臓幹細胞22及び骨髄単核細胞を23~25は 、臨床試験で試験されています。最初の結果の多くは21,23,25を約 束してきたが、最初の利点は、多くの場合、時間26-29とともに減少します。同様の傾向が原因MSC補充に重要な機能的利益を表示するマウス操作心臓組織において報告されているが、利点は、長期培養1中持続しません。サブ最適な性能を根底にある細胞治療を支配するメカニズムの限られた知識です。どのように治療用細胞それらの有益な影響だけでなく、筋細胞nonmyocyte相互作用の潜在的な負の影響を及ぼし、心不全の患者のために、最小限の副作用で、臨床的に有意かつ持続的な利益をもたらす改善された治療法の開発を可能にする。より深く理解
ここでは、interrogに定義されたhECTsの使用を記載しています細胞ベースの治療のメカニズムを食べました。制御された組織組成物は、心筋細胞の性能に影響を与える特定の因子を同定することが不可欠です。我々はラットECTS 1で実証したように、直接目的の治療用細胞型（ 例えば 、MSCS）でhECTsを補完する、心筋細胞のパフォーマンスへの影響を明らかにすることができます。
次の多段階プロトコルは、マルチ組織バイオリアクターの製造に続いて、組織構造および機能分析の説明を結論、指向心臓幹細胞の分化から始まります。我々の実験は、NIH-承認H7ヒト胚性幹細胞（hESCの）ラインを使用して実行されます。しかし、次のプロトコルは、追加のhESCラインと同様の結果で三誘導多能性幹細胞（hiPSC）株を用いて試験されました。我々は、HECT製造における心筋細胞分化および成功効率は、特にfoは、細胞株に依存することができることを見出しました個々の患者由来のR hiPSCライン。このプロトコルに従うことにより、2個の6ウェルディッシュは、20日間分化さと十分な6定義された組織を作るために、ソートした後、約250万筋細胞を生み出す168万のhESC（ウェル当たり14万細胞）、の合計でメッキされています。
Protocol
Representative Results
Discussion
定義された人間工学的心臓組織（HECT）の構築は、人間の心筋細胞機能のより一貫性と信頼性の高いモデルを提供することができます。批判的に、システム内のすべての細胞および細胞外成分が知られており、従って、分化過程に起因する他の未知の細胞型の交絡の影響を除去し、所望のように操作することができます。急速な細胞増殖と高い収率のバランスをとるためには、分化は、理想的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、BDG、アメリカに香港TRS T13-706 / 11（KDC）、NIH（R01 HL113499）の研究助成協議会、KDCにTJC、NIH / NHLBI PEN契約HHSN268201000045CにNIH（1F30HL118923-01A1）によってサポートされていましたRJ、および香港特別行政区の研究助成評議会（TBRS、T13-706 / 11）に心臓協会（12PRE12060254）追加の資金調達をRLには、NIH DRB 5T32GM008553-18によって、およびシステムと発達におけるNIDCR、学際的訓練に訓練生としてTJCに提供されました生物学と先天異常T32HD075735。また、作者は感謝して技術支援のためのバイオリアクターとMamdouh Eldalyの加工の支援のためにニューヨークのシティカレッジのザーンセンターでアーサーAutzを認識したいです。我々はまた、寛大にヒト間葉系幹細胞を提供するための心臓分化に関するアドバイス博士ケネスBoheler、博士ジョシュアウサギに感謝します。
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
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