Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
Kardiyak doku mühendisliği daha yakın hem de fare kardiyomiyositlerinin 1-6 ve yapılan tam fonksiyonel, dayak dokular, insan kök hücresi kaynaklı kalp miyositlere 7-12 sonuçlarını yayınlayarak çoklu gruplar, son on yılda büyük ölçüde ilerlemiştir. Kalp doku mühendisliği alanında iki birincil ve esas bağımsız hedefler tarafından tahrik edilmektedir: 1) işlevini 4-6 iyileştirmek için kalpleri başarısız içine transplante edilebilir eksojen greft geliştirmek; ve 2) fizyoloji ve hastalık eğitimi için in vitro modellerinde geliştirmek, ya da terapötik gelişim 2,7 için tarama araçları olarak.
Üç boyutlu (3-D) hücre kültürü 3-D matrisi geleneksel 2-D tek tabakalı hücre kültürü daha doğal kalp mikro yansıtır, yeni nesil tarama araçları geliştirmek için gerekli olarak kabul edilir; Gerçekten hücre biyolojisi bazı yönlerini 2-D vs 3-D kültürlerinde 13,14 temelde farklıdır </sus>. hücre dışı bir matris, bir hücre popülasyonu: Buna ek olarak, işlenmiş kardiyak dokular tam olarak tanımlanmış bileşenlerin inşa edilir. Ekstraselüler matriks kompozisyonu (genellikle fibrin 9 veya kollajen 7,8,10) sıkı kontrol edilirken geleneksel mühendislik insan kalp dokuları için giriş hücre kompozisyon daha az bir yönlendirilmiş kalp farklılaşma hücrelerin tüm karışımı ile tanımlanır ya embriyonik kök hücreler (ESC 7,9) ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC 10,12) dokulara ilave edilir. Spesifik hücre hattı ve ikinci farklılaşma protokolünün verimliliğine bağlı olarak, kardiyomiyositlerin sonuçtaki yüzdesi üzerinden% 90 den az% 25, belirli kardiyomiyosit fenotipi arasında olabilir (yani, ventricular-, atrial-, kalp pili gibi ya da) Ayrıca bile olmayan kardiyomiyosit fraksiyon 15,16 derece heterojen ve farklılaşmış kardiyak m olgunluk değiştirebilir, değişir17 yocytes.
Son kardiyak doku mühendisliği çalışmaları kalp reporter insan embriyonik kök hücre hattı 8 veya hücre yüzey işaretleyicileri 18 farklılaşma kardiyak miyosit bileşenini izole etmek için kullanılan biriyle, hücrelerin giriş nüfusunu kontrol etmek için çalıştı. Sadece kalp miyositler oluşan başlangıçta doku ideal gibi görünüyor olsa da, bu gerçeği değil durumda olduğunu; Kalp miyositler 1 oranında: fibroblastlar yüksek seğirme kuvveti 8 üreten sadece kardiyak miyositler oluşan hECTs bazı gruplar, 3 bulma, fonksiyonel dokulara sıkıştırmak için başarısız. Canlı hücre sıralama için yüzey belirteçleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre seçim yöntemleri kullanılarak, tanımlanmış hücre populasyonlarına sahip hECTs oluşturmak mümkündür. Kardiyak olmayan stromal hücrelerin belirteçleri CD90 19,20 gibi, farazi fibroblast markeri olarak bir süre için uygun olduğu halde, kardiyak miyositler yüzey işaretleyicileri daha zor olmuşturtespit etmek. SIRPα insan kalp miyositlere 18 için belirlenen ilk kalp yüzey belirteçleri arasında yer aldı ve kalp soy için son derece seçici olduğu gösterilmiştir. Hücreler bir fibroblast-benzeri fenotip (Josowitz, yayınlanmamış gözlemler) sergileyen CD90 + nüfusu ile hemen hemen saf kardiyomiyositlerde verir – Son zamanlarda, iki sıralama SIRPα + ve CD90 için bulduk. Kardiyomiyositlerde ve CD90 + fibroblastlar – SIRPα + / CD90 1 kombinasyonu: Bu toplanan bulgulara dayanarak, burada biz bir 3 kullanan hECTs oluşturmak açıklar.
tamamen tanımlanmış insan kalp dokusu mühendisi yeteneği güçlü tarama araçları oluşturmak için değil, aynı zamanda gelişmekte olan hücreye ve gen bazlı kardiyak tedaviler araştırmak için bir model sistemleri geliştirmek için değil, sadece esastır. Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) 21 olmak üzere hücre tipleri kullanan kalp yetmezliği için özellikle çok sayıda hücre tedavileri, içinde </sup>, kardiyak kök hücreler 22 ve kemik iliği mononükleer hücreleri 23-25, klinik çalışmalarda test edilmiştir. İlk sonuçların pek 21,23,25 umut verici olsa da, ilk fayda genellikle zaman 26-29 üzerinde azalır. Benzer bir eğilim nedeniyle MSC takviyesi önemli bir fonksiyonel fayda gösterir kemirgen mühendislik kardiyak dokularda rapor edilmiştir, ancak fayda uzun vadeli kültürü 1 sırasında sürekli değildir. sub-optimal performans altında yatan hücre tedavileri düzenleyen mekanizmaların bizim sınırlı bilgidir. onların olumlu etkisi yanı sıra, miyosit-nonmyocyte etkileşimlerin potansiyel olumsuz sonuçların uygulamak nasıl tedavi hücreler daha derin bir anlayış, kalp yetmezliği olan hastalarda minimal yan etkileri klinik olarak anlamlı ve sürekli faydalar veren gelişmiş tedavilerin gelişimini, sağlayacaktır.
Burada, interrog tanımlanmış hECTs kullanımını tarifhücre tabanlı tedavinin mekanizmaları yedik. kontrollü doku kompozisyonu kardiyomiyosit performansını etkilemeden belirli faktörleri belirlemek önemlidir. Sıçan AKTS 1'de gösterildiği gibi, doğrudan ilgi terapötik hücre tipi (örneğin, MKH) ile hECTs tamamlayan, kardiyak miyosit performansı üzerindeki etkileri ortaya çıkarabilir.
Aşağıdaki çok adımlı protokol çoklu doku biyoreaktör imalatı izledi ve doku yapımı ve fonksiyonel analiz bir açıklama ile sonuçlandırılması, yönetmenliğini kardiyak kök hücre farklılaşması ile başlar. Bizim deneyler NIH onaylı H7 insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, aşağıdaki protokol ayrıca bir HESC hattı ve benzer sonuçlar ile üç uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) çizgileri kullanılarak test edilmiştir. Biz Hect üretiminde kardiyomiyosit farklılaşma ve başarı verimlilik, özellikle fo, hücre hattı bağımlı olabilir buldukBireysel hastalar türetilen R hiPSC hatları. Bu protokolü takip ederek, iki adet 6-kuyu yemekleri 20 gün boyunca ayırt ve yeterince altı tanımlanan dokuları yapmak için, sıraladıktan sonra yaklaşık 2,5 milyon miyositleri verir 1680000 hESC (oyuk başına 140,000 hücre), toplam kaplanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
tanımlanmış insan mühendisliği kalp dokularında (Hect) İnşaatı insan kalp miyosit fonksiyonunun daha tutarlı ve güvenilir bir model sağlayabilir. Kritik olarak, sistemdeki tüm hücre ve hücre-dışı bileşenler bilinmektedir ve dolayısıyla farklılaşma işleminden kaynaklanan diğer bilinmeyen hücre tipleri karıştırıcı etki çıkarılması istendiği gibi işlenebilir. hızlı hücre büyümesi ve yüksek verim dengelemek için, farklılaşma ideal dört gün sonra kaplama HESC% 75 birleşme nokt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma TJC, KDC, Amerikan BDG Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) araştırma hibe konseyi NIH / NHLBI PEN sözleşme HHSN268201000045C için NIH (1F30HL118923-01A1) tarafından desteklenmiştir Ek finansman rl NIH DRB 5T32GM008553-18 tarafından ve Sistemleri ve gelişimsel olarak NIDCR-Disiplinlerarası Eğitim bir staj olarak TJC sağlanmıştır kalp Derneği (12PRE12060254) RJ ve HKSAR Araştırma Hibe Konseyi (/ 11 T13-706 TBRS) Biyoloji ve Doğum Kusurları T32HD075735. Yazarlar ayrıca minnetle, teknik yardım için biyoreaktör ve Memduh Eldaly işleme ile yardım için New York City College of Zahn Merkezi'nde Arthur Autz kabul etmek istiyoruz. Biz de cömertçe insan mezenkimal kök hücreleri sağlamak için kalp farklılaşma tavsiye Dr. Kenneth Boheler, Dr. Joshua Hare teşekkür ederim.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
- Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
- Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
- Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial–a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
- Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
- Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
- Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
- Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
