정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
심장 조직 공학은 최근 두 쥐의 심근 1-6과에서 만든 완전한 기능을, 구타 조직, 인간 줄기 세포 유래 심장 근육 세포 7-12의 결과를 게시하는 여러 그룹으로, 지난 10 년간 크게 발전하고있다. 심근 조직 공학 분야는 두 가지 주요 본질적으로 독립적 인 목적에 의해 구동된다 : 1) 기능을 개선하기 위해 4-6 하트 실패에 이식 할 수 외래 이식을 개발; 2) 생리 및 질병 연구를위한 체외 모델에서 개발, 또는 치료 개발 2,7 선별 도구로합니다.
3 차원 (3-D) 세포 배양 물은 3-D 행렬은 기존의 2-D 단층 세포 배양 물보다 더 자연 심장 미세 환경을 반영하는 바와 같이, 차세대 스크리닝 도구 개발에 필수적인 것으로 간주된다; 실제로 세포 생물학의 일부 측면은 2-D 대 3-D 배양 13,14 근본적으로 다르다 </suP>. 세포 외 기질 및 세포 인구 : 또한, 설계 심장 조직이 완전히 정의 된 구성 요소로 구성되어있다. 세포 외 기질 성분 (일반적 피브린 9 콜라겐 7,8,10)이 엄격하게 통제하면서 전통적인 설계 인간의 심장 조직의 경우, 입력 셀 조성물은 덜의 지시 심장 분화에서 세포의 전체 혼합물로 정의된다 어느 배아 줄기 세포 (ESC 7,9) 또는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC 10, 12)는 조직에 추가. 특정 세포주에 사용 된 분화 프로토콜의 효율에 따라, 심근의 생성 비율이 90 % 이상 25 % 미만에서 특정 심근 표현형의 범위 일 수있다 (즉, ventricular-, atrial- 심박 형 또는) 수도도 아닌 심근 분획 (15, 16)을 매우 이질적인하고 차별화 된 심장 m의 성숙을 변경할 수 있습니다 다양17 yocytes.
최근 심근 조직 공학 연구는 심장 리포터 인간 배아 줄기 세포주 8 세포 표면 마커 (18)가 분화 심장 근세포 성분을 분리하는 데 사용되는 하나와, 셀 입력 인구를 제어하려고 하였다. 단지 심장 근육 세포로 구성 초기에 조직이 이상적 일 것 같다 있지만,이 사실이 아닌 경우에; 심장 근육 세포의 1의 비율 : 섬유 아세포가 가장 높은 트의 힘 (8)을 생산 전적으로 심장 근육 세포로 구성 hECTs 일부 그룹 3을 찾는, 기능 조직으로 압축하지 못한다. 생균 정렬 용 표면 마커를 포함하여 다양한 세포의 선택 방법을 이용함으로써, 한정된 세포 집단과 hECTs를 생성 할 수있다. 비 심장 기질 세포의 마커 CD90 19,20 이러한 추정 섬유 아세포 마커로서 당분간 사용할되었지만, 심장 근육 세포 표면 마커는보다 어려웠확인하다. SIRPα 인간 심장 근세포 18 식별 제 심장 표면 마커 사이이고 심장 리니지 고도로 선택적인 것으로 밝혀졌다. 세포 섬유 아세포와 같은 표현형 (Josowitz, 게시되지 않은 관찰)을 나타내는 CD90 + 인구, 거의 순수한 심근 세포를 얻을 수 – 최근에, 우리는 두 번 정렬 SIRPα + 및 CD90에 대한이 있음을 발견했다. 심근 세포와 CD90 + 섬유 아세포 – SIRPα + / CD90의 1 조합 :이 수집 된 결과를 바탕으로, 여기에 우리는 3를 사용하여 hECTs을 만들 설명합니다.
완전히 정의 인간 심장 조직을 설계하는 능력은 강력한 선별 도구를 만드는, 또한 새로운 세포 – 기반 유전자 심장 치료를 조사하기위한 모형을 개발하는 시스템뿐만 아니라 필수적이다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) (21)를 포함한 세포 유형 이용한 심부전 특히, 다수의 세포 치료에서, </SUP>, 심장 줄기 세포 (22) 및 골수 단핵구 23-25은 임상 시험에서 시험되고있다. 초기 결과 많은 21,23,25 유망되었지만, 초기 이득은 종종 26-29 시간에 걸쳐 감소한다. 유사한 경향으로 인해 MSC 보충에 중요한 기능적 이득을 표시 뮤린 설계 심장 조직에서보고되었지만 이득 장기 배양 한 동안 유지되지 않는다. 서브 최적의 성능을 기본 것은 세포 치료를 지배하는 메커니즘의 우리의 제한된 지식이다. 자신의 유익한 영향뿐만 아니라 심근-nonmyocyte 상호 작용의 잠재적 인 부정적 영향을 미치는 방법을 치료 세포의 깊은 이해는 심부전 환자에 대한 최소한의 부작용이 임상 적으로 유의 한 지속적인 혜택을 얻었다 개선 된 치료법의 개발을 활성화합니다.
여기, 우리는 interrog 정의 hECTs의 사용을 설명세포 기반 치료의 메커니즘을 먹었다. 제어 조직 조성물은 심근 성능에 영향을 특정 요소를 식별하는 데 중요하다. 우리 래트 ECTS 1에서 보여준 바와 같이 직접 관심 치료 세포 유형 (예, 중간 엽 줄기 세포)를 hECTs 보충, 심장 근세포의 성능에 미치는 영향을 나타내있다.
다음 다단계 프로토콜 멀티 조직 생물 반응기의 제조이어서, 조직 구조 및 기능 분석에 대한 설명으로 종결 지시 된 심장 줄기 세포의 분화와 함께 시작된다. 우리의 실험은 NIH 승인 H7 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인을 사용하여 수행됩니다. 그러나, 다음의 프로토콜들이 또한 추가 hESC의 라인과 유사한 결과 세 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 라인을 사용하여 테스트되었다. 우리는 hECT 제조에서 심근 차별화와 성공의 효율성, 특히 fo를, 세포주 의존 할 수 있다는 것을 발견했다개별 환자에서 파생 된 연구 hiPSC 라인. 이 프로토콜에 따라, 두 개의 6 잘 요리 20 일 동안 차별화 충분히 여섯 정의 된 조직을 만들기 위해, 정렬 후 약 250 만 근육 세포를 얻을 수 1,680,000 hESCs는 (물론 당 140,000 셀), 총으로 도금되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정의 인간 공학 심장 조직 (hECT)의 건축은 인간의 심장 심근 기능의 일관성과 신뢰성있는 모델을 제공 할 수 있습니다. 결정적으로, 시스템의 모든 세포 및 세포 외 성분은 공지되어 있으며, 따라서 분화 과정으로 인한 다른 미지의 세포 유형의 교란의 영향을 제거하고 원하는대로 조작 할 수있다. 빠른 세포 증식과 높은 수율의 균형을 위해서, 이상적으로 분화 사일 도금 후 hESCs는 75 %의 합류점에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 TJC, KDC, 미국 BDG 홍콩 TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499)의 연구 보조금위원회에 NIH / NHLBI PEN 계약 HHSN268201000045C에 NIH (1F30HL118923-01A1)에 의해 지원되었다 추가 자금을 RL하는 NIH DRB 5T32GM008553-18에 의해 시스템 및 발달에 NIDCR – 학제 간 교육에 traineeship로 TJC에 제공 한 심장 협회 (12PRE12060254) RJ, 그리고 홍콩 특별 행정구의 연구 그랜트위원회 (/ 11 T13-706가 TBRS) 생물학, 출생 결함 T32HD075735. 저자는 또한 감사 기술 지원을위한 생물 반응기 및 Mamdouh Eldaly 가공과 지원을 뉴욕의 도시 대학은 Zahn 센터에서 아서 Autz을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 아낌없이 인간 중간 엽 줄기 세포를 제공하기 위해 심장 차별화에 대한 조언 박사 케네스 Boheler, 박사 여호수아 토끼 감사합니다.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
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