निर्धारित मानव इंजीनियर कार्डिएक ऊतकों के निर्माण हृदय सेल थेरेपी के तंत्र का अध्ययन करने के लिए
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
हृदय ऊतक इंजीनियरिंग पूरी तरह कार्यात्मक, पिटाई और अधिक हाल ही में दोनों murine cardiomyocytes 1-6 और, से बना ऊतकों, मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न हृदय myocytes 7-12 के परिणामों को प्रकाशित करने के लिए कई समूहों के साथ पिछले एक दशक में काफी उन्नत है, किया गया है। हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में दो प्राथमिक और अनिवार्य रूप से स्वतंत्र लक्ष्यों से प्रेरित है: 1) बहिर्जात ग्राफ्ट कि समारोह में 4-6 सुधार करने के लिए दिल में नाकाम रहने में प्रत्यारोपित किया जा सकता है विकसित करने के लिए; और 2) शरीर विज्ञान और रोग के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल में विकसित करने, या चिकित्सीय विकास 2,7 के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में करने के लिए।
तीन आयामी (3-डी) सेल संस्कृति अगली पीढ़ी स्क्रीनिंग उपकरणों के विकास, के रूप में 3-डी मैट्रिक्स पारंपरिक 2-डी monolayer सेल संस्कृति की तुलना में एक अधिक प्राकृतिक हृदय microenvironment दर्शाता है के लिए आवश्यक माना जाता है; वास्तव में कोशिका जीव विज्ञान के कुछ पहलुओं को 2-डी बनाम 3-डी संस्कृतियों 13,14 में मौलिक रूप से अलग हैं </sup>। एक बाह्य मैट्रिक्स, और एक सेल की आबादी: इसके अतिरिक्त, इंजीनियर हृदय के ऊतकों को पूरी तरह से परिभाषित घटकों से निर्माण कर रहे हैं। परंपरागत रूप से इंजीनियर मानव हृदय के ऊतकों के लिए, जबकि बाह्य मैट्रिक्स संरचना (आमतौर पर आतंच 9 या कोलेजन 7,8,10) सख्ती से नियंत्रित किया जाता है, इनपुट कक्ष रचना कम अच्छी तरह से, कोशिकाओं के पूरे मिश्रण के साथ की एक निर्देशित हृदय भेदभाव से परिभाषित किया गया है या तो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी 7.9) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSC 10,12) ऊतकों को जोड़ा जा रहा है। विशेष सेल लाइन और भेदभाव इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की क्षमता पर निर्भर करता है, cardiomyocytes के परिणामस्वरूप प्रतिशत, 90% से अधिक करने के लिए कम से कम 25% से लेकर कर सकते हैं विशिष्ट cardiomyocyte फेनोटाइप (यानी, ventricular-, atrial-, या पेसमेकर की तरह) यह भी भिन्न हो सकते हैं, यहां तक कि गैर cardiomyocyte अंश बेहद विषम 15,16 हो सकता है और अलग-अलग हृदय मीटर की परिपक्वता को बदल सकते हैं17 yocytes।
हाल हृदय ऊतक इंजीनियरिंग का काम या तो एक हृदय संवाददाता मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन 8 या कोशिका की सतह मार्करों 18 भेदभाव के हृदय myocyte घटक को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, कोशिकाओं के इनपुट जनसंख्या को नियंत्रित करने का प्रयास किया गया। शुरू में एक ही हृदय myocytes से बना ऊतक आदर्श होना प्रतीत होता है, वहीं इस तथ्य नहीं मामले में है; पूरी तरह से हृदय myocytes से बना hECTs, कार्यात्मक ऊतकों में संकुचित करने में विफल कुछ समूहों 3 खोजने के साथ: हृदय myocytes की: 1 के अनुपात fibroblasts उच्चतम चिकोटी बल 8 का निर्माण किया। विभिन्न सेल चयन के तरीकों का उपयोग कर, जीना सेल छँटाई के लिए सतह मार्कर सहित करके, इसे परिभाषित सेल आबादी के साथ hECTs बनाने के लिए संभव है। जबकि गैर-हृदय stromal कोशिकाओं के मार्कर के इस तरह के ख्यात fibroblast मार्कर के रूप में कुछ समय के लिए उपलब्ध किया गया है, CD90 19,20, हृदय myocytes की सतह मार्कर अधिक मुश्किल हो गया हैपहचान करने के लिए। SIRPα पहले हृदय की सतह मार्कर मानव हृदय myocytes 18 के लिए पहचान के बीच था और हृदय वंश के लिए अत्यधिक चयनात्मक होना दिखाया गया है। हाल ही में, हमने पाया है कि डबल-छंटाई के लिए SIRPα + और CD90 है – कोशिकाओं लगभग शुद्ध cardiomyocytes पैदावार, CD90 + जनसंख्या एक fibroblast-तरह phenotype (Josowitz, अप्रकाशित टिप्पणियों) प्रदर्शन के साथ। Cardiomyocytes और CD90 + fibroblasts – SIRPα + / CD90 के 1 संयोग: इन निष्कर्षों के आधार पर एकत्र, के साथ साथ हम एक 3 का उपयोग hECTs बनाने का वर्णन है।
एक पूरी तरह से परिभाषित मानव हृदय के ऊतकों इंजीनियर करने की क्षमता आवश्यक न केवल मजबूत स्क्रीनिंग उपकरण बनाने के लिए, लेकिन यह भी मॉडल प्रणाली विकसित करने में उभर सेल और जीन के आधार पर हृदय उपचारों की जांच करने के लिए है। दिल की विफलता के लिए विशेष रूप से, कई सेल उपचार, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी), 21 सहित प्रकार की कोशिकाओं के उपयोग में </sup>, कार्डियक स्टेम कोशिकाओं को 22 और अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear 23-25, क्लिनिकल परीक्षण में परीक्षण किया गया है। हालांकि शुरुआती परिणामों के कई 21,23,25 वादा किया गया है, प्रारंभिक लाभ अक्सर समय 26-29 ओवर कम हो। ऐसा ही एक प्रवृत्ति murine इंजीनियर हृदय के ऊतकों, एमएससी पूरकता के कारण जो एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक लाभ प्रदर्शित की रिपोर्ट में किया गया है, लेकिन लाभ लंबे समय तक संस्कृति 1 के दौरान निरंतर नहीं है। उप इष्टतम प्रदर्शन अंतर्निहित सेल उपचार गवर्निंग तंत्र के बारे में हमारी सीमित ज्ञान है। कैसे चिकित्सीय कोशिकाओं उनके लाभकारी प्रभाव है, साथ ही myocyte-nonmyocyte बातचीत के संभावित नकारात्मक परिणाम डालती की एक गहरी समझ, चिकित्सकीय महत्वपूर्ण और निरंतर लाभ उपज में सुधार उपचारों के विकास, कम से कम साइड इफेक्ट के साथ, दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए सक्षम होगा।
यहाँ, हम interrog को परिभाषित hECTs के उपयोग का वर्णनसेल आधारित चिकित्सा के तंत्र खा लिया। नियंत्रित ऊतक रचना cardiomyocyte प्रदर्शन को प्रभावित विशिष्ट कारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक है। सीधे ब्याज की चिकित्सीय सेल प्रकार (जैसे, MSCs) के साथ hECTs सप्लीमेंट, हृदय myocyte प्रदर्शन पर प्रभाव प्रकट कर सकते हैं, जैसा कि हम चूहे ECTS 1 में प्रदर्शन किया है।
निम्नलिखित बहु कदम प्रोटोकॉल का निर्देश कार्डियक स्टेम सेल भेदभाव के साथ शुरू होता है, बहु-ऊतक बायोरिएक्टर के निर्माण के द्वारा पीछा किया, और ऊतकों के निर्माण और कार्यात्मक विश्लेषण का एक विवरण के साथ समापन। हमारे प्रयोगों एनआईएच को मंजूरी दे दी H7 मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) लाइन का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, निम्नलिखित प्रोटोकॉल भी एक अतिरिक्त hESC लाइन और तीन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) इसी तरह के परिणाम के साथ लाइनों का उपयोग कर परीक्षण किया गया है। हमने पाया है कि cardiomyocyte भेदभाव और हेक्टेयर निर्माण में सफलता में दक्षता सेल लाइन निर्भर हो सकता है, खासकर के लिएआर hiPSC लाइनों व्यक्ति के रोगियों से निकाली गई। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, दो 6 अच्छी तरह से व्यंजन 16.8 लाख hESCs (अच्छी तरह से प्रति 140,000 कोशिकाओं) है, जो 20 दिनों के लिए फर्क और छँटाई, पर्याप्त छह परिभाषित ऊतक बनाने के बाद लगभग 25 लाख myocytes पैदावार की कुल के साथ चढ़ाया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
परिभाषित मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों (हेक्टेयर) का निर्माण मानव हृदय myocyte समारोह का एक और अधिक सुसंगत और विश्वसनीय मॉडल प्रदान कर सकते हैं। गंभीर, सिस्टम में सभी सेलुलर और बाह्य घटकों में जाना जाता है और …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच (1F30HL118923-01A1) TJC, KDC, हांगकांग टीआरएस T13-706 / 11 (KDC), एनआईएच (R01 HL113499) BDG करने के लिए, अमेरिकी के अनुसंधान अनुदान परिषद के लिए एनआईएच / NHLBI कलम अनुबंध HHSN268201000045C द्वारा समर्थित किया गया हार्ट एसोसिएशन (12PRE12060254) आरजे करने के लिए, और HKSAR के अनुसंधान अनुदान परिषद (TBRS, T13-706 / 11) अतिरिक्त धन आरएल को एनआईएच DRB 5T32GM008553-18 द्वारा और सिस्टम्स और विकास में NIDCR-अंतःविषय प्रशिक्षण पर एक ट्रेनिंग के रूप में TJC करने के लिए प्रदान किया गया जीवविज्ञान और जन्म दोष T32HD075735। लेखकों को भी कृतज्ञता बायोरिएक्टर और तकनीकी सहायता के लिए Mamdouh Eldaly मशीनिंग के साथ सहायता के लिए न्यूयॉर्क के सिटी कॉलेज के Zahn सेंटर में आर्थर Autz स्वीकार करना चाहते हैं। हम यह भी उदारता से मानव mesenchymal स्टेम सेल प्रदान करने के लिए हृदय भेदभाव पर सलाह के लिए डॉ केनेथ Boheler, और डॉ यहोशू हरे धन्यवाद।
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
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