Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

Cardiac tissue engineering har avansert kraftig i det siste tiåret, med flere grupper publisering resultatene av fullt funksjonelle, slo vev laget av både murine cardiomyocytes ^1-6 og, mer nylig, menneskestamcelle-avledet hjertemuskelceller ^7-12. Den hjerte tissue engineering feltet er drevet av to primære og hovedsak uavhengige mål: 1) å utvikle eksogene grafts som kan transplanteres inn i sviktende hjerter for å bedre funksjon ^4-6; og 2) å utvikle seg in vitro modell for å studere fysiologi og sykdom, eller som screening verktøy for utvikling av terapeutiske medikamenter ^2,7.

Tre-dimensjonal (3-D) cellekultur er ansett som nødvendig for å utvikle neste generasjon screening verktøy, som 3-D matrise reflekterer en mer naturlig hjertemikromiljøet enn tradisjonelle to-D monolagscellekultur; faktisk noen aspekter av cellebiologi er fundamentalt forskjellig i 2-D vs 3-D kulturer ^13,14 </sup>. I tillegg er konstruert for hjertevev oppbygget av fullstendig definerte komponenter: en ekstracellulær matriks, og en cellepopulasjon. For tradisjonelle modifiserte humane kardiale vev, mens den ekstracellulære matrise-blandingen (vanligvis fibrin ⁹ eller kollagen ^7,8,10) er strengt kontrollert, inngangscellen sammensetningen blir mindre godt definert, med hele blandingen av celler fra en rettet kardial differensiering av enten embryonale stamceller (ESC ^7,9) eller induserte pluripotente stamceller (IPSC ^10,12) blir lagt til vevene. Avhengig av den spesifikke cellelinjen og effektiviteten av differensiering protokollen som brukes, kan den resulterende prosentandelen av kardiomyocytter varierer fra under 25% til over 90%, det spesifikke kardiomyocytt fenotype (dvs. ventricular-, atrial-, eller pacemaker-lignende) kan også variere, selv de ikke-kardiomyocytt brøkdel kan være svært heterogen ^15,16 og endre modenhet av differensiert hjerte myocytes ^17.

Nylige hjertevev ingeniørarbeid har forsøkt å kontrollere inngangs populasjon av celler, med enten en hjerte reporter humane embryonale stamceller linje ⁸ eller celleoverflatemarkører ¹⁸ blir brukt til å isolere den kardiale myocyte komponenten av differensiering. Selv om utgangspunktet en vev sammensatt av bare i hjertemuskelceller ville synes å være den ideelle, er dette faktisk ikke er tilfelle; hECTs sammensatt utelukkende av hjertemuskelceller mislykkes i å komprimere i funksjonelle vev, med enkelte grupper finne et 3: 1 forhold av hjertemuskelceller: fibroblaster fremstilling av det høyeste trekning kraft ^8. Ved hjelp av forskjellige celleutvelgelsesmetoder, inkludert overflatemarkører for levende cellesortering, er det mulig å lage hECTs med definerte celle populasjoner. Mens markører for ikke-hjerte stromale celler har vært tilgjengelige i noen tid, slik som den antatte fibroblast markør CD90 ^19,20, har overflatemarkører av hjertemuskelceller vært vanskeligereå identifisere. SIRPα var blant de første kardiale overflatemarkører som er identifisert for menneskehjertemuskelceller ¹⁸ og har vist seg å være meget selektive for hjerte avstamning. Nylig har vi funnet ut at dobbel-sortering for SIRPα ⁺ og CD90 ^– celler gir nesten rene cardiomyocytes, med CD90 ⁺ befolkningen viser en fibroblast-lignende fenotype (Josowitz, upubliserte observasjoner). Basert på disse funnene er samlet, heri beskriver vi skape hECTs ved anvendelse av en 3: 1 blanding av SIRPα ⁺ / CD90 ^– kardiomyocytter og CD90 ⁺ fibroblaster.

Evnen til å konstruere et fullstendig definert humant hjertevev er viktig ikke bare for å lage robuste screening verktøy, men også for å utvikle modellsystemer for å undersøke frem celle- og gen-baserte hjerte terapier. Spesielt mange cellen terapi for hjertesvikt, utnytte celletyper, inkludert mesenchymale stamceller (MSC) ²¹ </sup>, hjerte stamceller ²² og benmarg mononukleære celler ^23-25, har blitt testet i kliniske studier. Mens mange av de første resultatene har vært lovende ^21,23,25, minsker den første fordelen ofte over tid ^26-29. En lignende trend har blitt rapportert i murine utviklet hjerte vev, som viser en betydelig funksjonell fordel på grunn av MSC tilskudd, men fordelen er ikke vedvarende ved langtids kultur ^1. Underliggende sub-optimal ytelse er vår begrensede kunnskap om mekanismene som styrer cellen terapi. En dypere forståelse av hvordan terapeutiske celler utøve sin gunstig innflytelse, samt mulige negative konsekvenser av myocyte-nonmyocyte interaksjoner, vil muliggjøre utvikling av bedre behandlingsformer som gir klinisk signifikante og vedvarende fordeler, med minimale bivirkninger, for pasienter med hjertesvikt.

Her beskriver vi bruk av definerte hECTs til interrogspiste mekanismer for cellebasert terapi. Den kontrollerte vevssammensetning er avgjørende for å identifisere spesifikke faktorer som påvirker kardiomyocytt ytelse. Direkte supplere hECTs med den terapeutiske celletype av interesse (f.eks MSC), kan avsløre effekter på hjertets muskelceller ytelse, som vi har vist i rotte studiepoeng ^1.

Den følgende flertrinns protokoll begynner med rettet hjertestamcelledifferensiering, etterfulgt av fremstillingen av multi-vev bioreaktor, og avsluttende med en beskrivelse av vev konstruksjon og funksjonell analyse. Våre eksperimenter er utført ved hjelp av NIH-godkjent H7 humane embryonale stamceller (hESC) linje. Imidlertid har de følgende protokoller også blitt testet ved hjelp av en ekstra hESC linje og tre induserte pluripotent stamcelle (hiPSC) linjer med lignende resultater. Det er funnet at effektiviteten i kardiomyocytt differensiering og suksess i hect fabrikasjon kan være avhengige cellelinje, spesielt for hiPSC linjene fra individuelle pasienter. Ved å følge denne protokoll, er to seks-brønners skåler belagt med et total på 1,68 millioner hESCs (140.000 celler per brønn), noe som gir ca. 2,5 millioner myocytter etter differensiering i 20 dager og sortering, nok til å gjøre seks definerte vev.

Protocol

Merk: Utfør alle celle manipulasjoner i aseptiske forhold ved hjelp av et HEPA-filtrert klasse II biologisk sikkerhetskabinett og sterilisere alle løsninger ved å filtrere dem gjennom et 0,2 mikrometer filter. Utfør vev konstruksjon og funksjonsprøving i enten samme aseptiske forhold eller en laminær hette. 1. Seeding av H7 hESCs i Forberedelse til Cardiac Differensiering (Dag 1) Klarbasalmembran Matrix Tine 150 ul delmengde av hESC kvalifiserte basalmembran matrix …

Representative Results

For å få hjertemuskelceller, er en litt modifisert versjon av Boheler og Lian differensiering metoder brukt 30,31. Det er viktig at differensieringen begynner i løpet av log-fasen av cellevekst, men også at utgangspopulasjon er tilstrekkelig konfluent for å oppnå en brukbar antall celler etter sortering (ca. 75% er optimalt). Typisk for H7 hESCs, plettering ved en tetthet på 140.000 hESCs per brønn i en 6-brønners skål i vesentlig 8 medier og 5% CO2 inkubator holdt ved 37 ° C gir tilstre…

Discussion

Bygging av definerte menneske konstruerte kardiale vev (hect) kan gi en mer konsistent og pålitelig modell av menneskelig hjerte myocyte funksjon. Kritisk, blir alle cellulære og ekstracellulære komponenter i det system som er kjent og kan manipuleres etter ønske, og dermed fjerne den forvirrende innvirkning av andre ukjente celletyper som følge av differensieringsprosessen. For å balansere rask cellevekst og høyt utbytte, er det foretrukket at differensieringen starter ved 75% konfluens av de hESCs, helst fire d…

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors