Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

Hjärtvävnad engineering har avancerat kraftigt under det senaste decenniet, med flera grupper publicera resultaten av fullt fungerande, slå vävnader tillverkad av både murina cardiomyocytes ^1-6 och, på senare tid, mänskliga stamceller härledda hjärtmyocyter ^7-12. Hjärtvävnadsteknik fält drivs av två primära och väsentligen oberoende mål: 1) att utveckla exogena transplantat som kan transplanteras in inte hjärtan för att förbättra funktionen ^4-6; och 2) att utveckla in vitro-modeller för att studera fysiologi och sjukdom, eller som screeningverktyg för terapeutisk utveckling ^2,7.

Tredimensionell (3-D) cellodling anses nödvändig för att utveckla nästa generations analysverktyg, som 3-D matris återspeglar en mer naturlig hjärtmikro än traditionella 2-D monolager cellodling; faktiskt vissa aspekter av cellbiologi är fundamentalt olika i 2-D vs 3-D kulturer ^13,14 </sup>. Dessutom är manipulerade hjärtvävnader tillverkade av helt definierade komponenter: en extracellulär matris, och en cellpopulation. För traditionella manipulerade humana hjärtvävnader, medan den extracellulära matriskompositionen (vanligen fibrin ⁹ eller kollagen ^7,8,10) är strikt kontrollerad, ingångscellkomposition är mindre väl definierad, med hela blandningen av celler från en riktad hjärt differentiering av antingen embryonala stamceller (ESC ^7,9) eller inducerade pluripotenta stamceller (IPSC ^10,12) läggs till vävnaderna. Beroende på den specifika cellinjen och effektiviteten i differentieringsprotokoll som används, kan den resulterande andel av kardiomyocyter variera från mindre än 25% till över 90%, den specifika cardiomyocyte fenotyp (dvs ventricular-, atrial- eller pacemaker-liknande) kan också variera, även icke-cardiomyocyte fraktion kan vara mycket heterogen ^15,16 och ändra löptiden för den differentierade hjärt myocytes ^17.

Senaste hjärtvävnad ingenjörsarbete har försökt att styra ingångs population av celler, med antingen en hjärt reporter human embryonal stamcellslinje ⁸ eller cellytmarkörer ¹⁸ används för att isolera hjärt myocyte komponenten av differentiering. Även initialt en vävnad som består av endast hjärtmyocyter verkar vara den idealiska, är detta i själva verket inte fallet; hECTs som består endast av hjärtmyocyter misslyckas med att kompaktera i funktionella vävnader, med vissa grupper att hitta en 3: 1 förhållande av hjärtmyocyter: fibroblaster som producerar den högsta rycka kraft ^8. Genom att använda olika urvals cell metoder, inklusive ytmarkörer för levande cellsortering, är det möjligt att skapa hECTs med definierade cellpopulationer. Medan markörer för icke-hjärt stromaceller har funnits under en längre tid, såsom den förmodade fibroblast markören CD90 ^19,20, har ytmarkörer av hjärtmuskelceller varit svårareatt identifiera. SIRPα var bland de första hjärt ytmarkörer identifierats för mänskliga hjärtmuskelceller ¹⁸ och har visat sig vara mycket selektiva för hjärt härstamning. Nyligen har vi funnit att dubbelsortering för SIRPα ⁺ och CD90 ^– celler ger nästan rena kardiomyocyter, med CD90 ⁺ populationen som uppvisar en fibroblast-liknande fenotyp (Josowitz, opublicerade observationer). Baserat på dessa insamlade fynd, här beskriver vi skapar hECTs med hjälp av en 3: 1 blandning av SIRPα ⁺ / CD90 ^– hjärtmuskelceller och CD90 ⁺ fibroblaster.

Förmågan att konstruera en helt definierad human hjärtvävnad är viktigt inte bara för att skapa robusta screeningverktyg, men även för att utveckla modellsystem för att undersöka nya cell- och genbaserade hjärt terapier. I synnerhet många cellterapi för hjärtsvikt, utnyttjar celltyper inklusive mesenkymala stamceller (MSC) ²¹ </sup>, har hjärt stamceller ²² och benmärgsmononukleära celler ^23-25, testats i kliniska prövningar. Även om många av de första resultaten har varit lovande ^21,23,25, minskar den initiala fördel ofta över tiden ^26-29. En liknande trend har rapporterats i murina konstruerad hjärtvävnader, som visar en betydande funktionell fördel på grund av MSC tillskott, men fördelen är inte upprätt under långtidsodling ^en. Bakom sub-optimal prestanda är vår begränsade kunskap om de mekanismer som styr cellterapier. En djupare förståelse av hur terapeutiska celler utöva sin välgörande inflytande, liksom eventuella negativa konsekvenser av myocyt-nonmyocyte interaktioner, skulle göra det möjligt att utveckla förbättrade behandlingar ger kliniskt signifikanta och varaktiga fördelar, med minimala biverkningar för patienter med hjärtsvikt.

Här beskriver vi användningen av definierade hECTs att interrogåt mekanismerna för cellbaserad terapi. Den kontrollerade vävnadssammansättning är viktigt att identifiera specifika faktorer som påverkar cardiomyocyte prestanda. Direkt komplettera hECTs med den terapeutiska celltypen av intresse (t.ex. MSC) kan avslöja effekterna på hjärt myocyte prestanda, som vi har visat i rått ECT ^1.

Följande flerstegsprotokoll börjar med riktad hjärtstamcellsdifferentiering, följt av tillverkning av flervävnads bioreaktor, och sluta med en beskrivning av vävnads konstruktion och funktionell analys. Våra experiment utförs med hjälp av NIH-godkända H7 mänskliga embryonala stamceller (hESC) linje. Emellertid har följande protokoll också testats med användning av en ytterligare hESC linje och tre inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer med liknande resultat. Vi har funnit att effektiviteten i cardiomyocyte differentiering och framgång i Hect tillverkning kan vara cellinje beroende, särskilt for hiPSC linjer som härrör från enskilda patienter. Genom att följa detta protokoll, två 6-brunnar pläterad med totalt 1,68 miljoner hESCs (140.000 celler per brunn), vilket ger cirka 2,5 miljoner myocyter efter differentiering i 20 dagar och sortering, tillräckligt för att göra sex definierade vävnader.

Protocol

Obs: Utför alla cell manipulationer i aseptiska betingelser med användning av ett HEPA-filtrerad klass II biologiskt säkerhetsskåp och sterilisera alla lösningar genom att filtrera dem genom ett 0,2 pm filter. Utföra vävnads uppbyggnad och funktion testning i antingen samma aseptiska förhållanden eller ett dragskåp med laminärt flöde. 1. Sådd av H7 hESCs i Förberedelse för hjärt differentiering (Dag 1) Förberedelse av Basement Membrane Matrix Tina 150 pl …

Representative Results

För att få hjärtmuskelceller, är en något modifierad version av Boheler och Lian differentieringsmetoder som används 30,31. Det är absolut nödvändigt att differentieringen startar under log-fasen av celltillväxt, men också att utgångspopulationen är tillräckligt konfluent för att erhålla en användbar antal celler efter sortering (ca 75% är optimalt). Typiskt för H7 hESCs, plätering vid en densitet av 140.000 hESCs per brunn i en 6-brunnsskål i väsentlig 8 medier och 5% CO2 ink…

Discussion

Konstruktion av definierade mänskliga tekniska hjärtvävnad (Hect) kan ge en mer konsekvent och tillförlitlig modell av human hjärt myocyte funktion. Kritiskt, är alla cellulära och extracellulära komponenter i systemet är kända och kan manipuleras enligt önskemål, på så sätt avlägsna den confounding påverkan av andra okända celltyper till följd av differentieringsprocessen. Att balansera snabb celltillväxt och hög avkastning, är det att föredra att differentieringen börjar vid 75% sammanflytning …

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors