Sporing og kvantificere udviklingsprocesser i<em> C. elegans</em> Brug Open source Værktøj
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Kvantitativt opfange udviklingsprocesser er afgørende for at udlede mekanistiske modeller og nøgle til at identificere og beskrive mutant fænotyper. Her protokoller præsenteres for udarbejdelsen embryoner og voksne C. elegans dyr til kort- og langsigtede time-lapse mikroskopi og metoder til sporing og kvantificering af udviklingsprocesser. De metoder, der præsenteres er alle baseret på C. elegans stammer rådighed fra Caenorhabditis Genetik Center og på open source-software, der let kan implementeres i alle laboratorier uafhængigt af mikroskopi, der anvendes. En rekonstruktion af en 3D-celle-form model ved hjælp af modellering software israelske forsvarsminister, manuel sporing af fluorescens-mærkede subcellulære strukturer ved hjælp af multi-purpose billede analyseprogram Endrov, og en analyse af kortikal kontraktile flow ved hjælp PIVlab (tidsopløst Digital Particle Billede Velocimetri Værktøj til Matlab) er vist. Det diskuteres, hvordan disse metoder kan også sættes ind to kvantitativt fange andre udviklingsprocesser i forskellige modeller, fx sporing og afstamning celle sporing, sporing af vesikel flow.
Introduction
Med den stadige forbedringer af fluorescerende proteiner, genom teknik, lysmikroskopi, og edb soft- og hardware, er det nu muligt at registrere udviklingen af mange modelorganismer på hidtil uset spatio-temporale opløsning. Dette gør det muligt for forskerne at stille spørgsmål, der ikke kunne løses tidligere eller til at gense kendte udviklingsprocesser for at søge efter oversete aspekter. Denne udvikling har udløst inden for kvantitative udviklingsmæssige biologi, som sigter mod at omdanne kvalitative, uformelle modeller i kvantitative modeller af grundige målinger og statistiske analyser.
Sporing celler og subcellulære strukturer har gjort det muligt at udlede kvantitative modeller for fosterudvikling, nervesystem aktivitet, eller celledeling 1-12. Ved at spore celledeling rester i den tidlige udvikling af C. elegans embryo, kunne vi for nylig afsløre, at de følger en stereoindtastet sti og udgør et vigtigt polariserende faktorer 13,14.
Her bliver protokoller præsenteres der gør kvantitativ udviklingsmæssige biologi tilgange tilgængelig for ikke-eksperter. Fokus ligger på tre straight-forward, frit tilgængelige værktøjer, der er implementeres i ethvert laboratorium, der har adgang til standard konfokal mikroskopi og computere. Disse omfatter en protokol til at generere 3D-celle figurer, en protokol til at spore celle division rester, og en protokol til kvantitativt at beskrive kortikale actomyosin dynamik. Nematoden C. elegans anvendes som et eksempel tilfældet, men de metoder og værktøjer, der gennemgås her, er velegnet til en række spørgsmål inden for andre biologiske modeller, f.eks dyrkede celler, vævseksplantater, organoids eller sfæroider, andre embryoner osv
Generelt nogle af analyserne er vist her, kan også udføres med den populære open source værktøj ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; eller Fiji, Den 'batterier' version af ImageJ, http://fiji.sc/Fiji), for hvilke mange plugins til forskellige kvantitative analyser er tilgængelige. Men de programmer, diskuteret her er designet til at løse specifikke problemer.
For det første israelske forsvarsminister, en billedbehandling, modellering og display suite kan bruges til 3D rekonstruktioner af serielle sektioner fra elektronmikroskopi eller lysmikroskopi 15. Israelske forsvarsminister indeholder også værktøjer til visning af 3D data fra hvilken som helst orientering. For det andet Endrov, et Java-program designet til at udføre billedanalyse, databehandling, og kommentering af netværk eller spor (bl.a.) på grundlag af en udvidet plugin arkitektur, med ImageJ plugin kompatibilitet 16. Den indeholder over 140 billeder-behandling, og en Extensible brugergrænseflade, hvor model og rådata vises separat. Dens kildekode kan findes på https://github.com/mahogny/Endrov. For det tredje, PIVlab, en MATLAB værktøj til digital partikel billedet Velocimetry, der giver brugeren mulighed for at kvantitativt og kvalitativt analysere partikelstrømmen felter 17. Brugen af denne programmer kræver en Matlab licens, der omfatter Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab er et program designet til kvantitativt at beskrive flow. Den beregner hastigheden distribution, størrelsesorden, vorticity, divergens, eller snitte inden billedfiler par eller serier. Til dette, er det cross-korrelerer små områder af billeder (kaldet "afleveringer" i protokollen sektionen) af et billede par for at udlede den mest sandsynlige partikel forskydning. Denne krydskorrelation giver et korrelation matrix, der kan analyseres i rummet eller frekvensdomænet under anvendelse af enten direkte krydskorrelation eller hurtig Fourier transformation (FFT), henholdsvis.
Udstyret bruges her er et inverteret mikroskop udstyret med en Nipkow (spinning) disk, en EMCCD, 488 og 561 nm standard fast-state lasere og 20x luft eller 40x eller 60x planen / Apochromat olie- eller vand-nedsænkning målsætninger. Det er imidlertid også muligt at udføre time-lapse billeddannelse med andre billeddannende modaliteter, fx punkt-, linie- eller plade-scanning laserbaseret mikroskopi, multi-foton mikroskopi, samt epi-fluorescensmikroskopi kombineret med udfoldning eller struktureret belysning. Fordelen ved at anvende en Nipkow disk system er den ekstremt hurtige billedoptagelse, især hvis en streaming-mode (kontinuerlig bevægelse og scanning af objektet i z dimension) er tilgængelig. Derudover, for at forbedre opløsning, en 1,5-fold forstørrelsesglas extender foran EMCCD anvendes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gennem objekt sporing i udvikling, især nuklear sporing, har det været muligt at belyse centrale mønsterdannende mekanismer C. elegans embryogenese 1,23,24. Udvidelse denne strategi til højere gennemløb, har det været for nylig muligt at afdække yderligere mønsterdannende regler og foreslå en metode, hvordan man udlede mønster regler de novo 10. For mange mutanter imidlertid de præcise mønsterruller defekter er stadig ukendt. De her beskrevne metoder er redskaber, der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
