تتبع وقياس العمليات التنموية في<em> C. ايليجانس</em> استخدام أدوات المصدر المفتوح
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
التقاط كميا العمليات التنموية أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النماذج الميكانيكية والمفتاح لتحديد ووصف الظواهر متحولة. هنا يتم عرض بروتوكولات لإعداد الأجنة وC. الكبار ايليجانس الحيوانات لقصيرة وطويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهر وطرق تتبع وتقدير من العمليات التنموية. الأساليب المقدمة تستند فقط على C. سلالات ايليجانس المتاحة من مركز علم الوراثة انواع معينة وعلى البرمجيات مفتوحة المصدر التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر مستقل عن نظام المجهر المستخدمة. A إعادة بناء نموذج 3D خلية الشكل باستخدام IMOD نماذج البرمجيات، وتتبع اليدوي الهياكل التحت خلوية fluorescently المسمى باستخدام متعددة الأغراض برنامج تحليل الصور Endrov، وتحليل تدفق مقلص القشرية باستخدام PIVlab (حل الزمن الرقمي الجسيمات صورة Velocimetry وأظهرت أداة لMATLAB). تم مناقشته كيف يمكن أيضا أن يتم نشر هذه الأساليب رس التقاط كميا العمليات التنموية الأخرى في نماذج مختلفة، على سبيل المثال، تتبع الخلايا والنسب تتبع، تتبع تدفق الحويصلة.
Introduction
مع التحسن المطرد من البروتينات الفلورية، والهندسة الجينية، المجهر الضوئي، والبرنامج التشغيلى الكمبيوتر والأجهزة، أصبح من الممكن الآن لتسجيل تطوير العديد من الكائنات النموذجية في القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. هذا يسمح للباحثين لطرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها سابقا أو لإعادة النظر في العمليات التنموية المعروفة من أجل البحث عن الجوانب تجاهلها. وأثار هذا التقدم في مجال البيولوجيا التطورية الكمي، الذي يهدف إلى تحويل، ونماذج رسمية النوعية في النماذج الكمية التي كتبها قياسات دقيقة والتحليلات الإحصائية.
جعلت خلايا تتبع والهياكل التحت خلوية من الممكن استخلاص النماذج الكمية من التطور الجنيني، نشاط الجهاز العصبي، أو انقسام الخلايا 12/01. من خلال تتبع بقايا انقسام الخلايا خلال التنمية في وقت مبكر من C. ايليجانس الجنين، يمكن أن تكشف مؤخرا أنها تتبع جهاز ستيريوعوامل كتبته مسار ويشكل الاستقطاب المهم 13،14.
هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تجعل النهج البيولوجيا التطورية الكمي للوصول لغير الخبراء. التركيز يكمن في ثلاث على التوالي إلى الأمام، والأدوات المتاحة بحرية التي يمكن أن تنفذها في أي مختبر لديه حق الوصول إلى معيار المجهري متحد البؤر وأجهزة الكمبيوتر. وتشمل هذه بروتوكول لتوليد الأشكال خلية 3D، وبروتوكول لتعقب فلول انقسام الخلايا، وبروتوكول لوصف كميا ديناميات أكتوميوزين القشرية. الديدان الخيطية C. يستخدم ايليجانس كحالة نموذجية، ومع ذلك، فإن أساليب وأدوات مناقشتها هنا هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الأسئلة في النماذج البيولوجية الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا المستزرعة، إإكسبلنتس الأنسجة، organoids أو الكروية والأجنة الأخرى، الخ
عموما، بعض التحليلات هو موضح هنا يمكن أيضا أن يؤديها مع شعبية مفتوحة المصدر أداة يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.أتش تي أم أل. أو في فيجي، "وشملت بطاريات" إصدار يماغيج، http://fiji.sc/Fiji) التي هي العديد من الإضافات للالتحليلات الكمية المختلفة المتاحة. ومع ذلك، فإن برامج مناقشتها هنا مصممة لمعالجة مشاكل محددة.
أولا، IMOD، ومعالجة الصور، والنمذجة وعرض جناح يمكن استخدامها لإعادة بناء 3D من مسلسل أقسام من الإلكترون المجهري أو ضوء 15. كما يحتوي IMOD أدوات للعرض البيانات 3D من أي اتجاه. ثانيا، Endrov، وهو برنامج جافا المصممة لإجراء تحليل الصورة، ومعالجة البيانات، والشرح الشبكات أو المسارات (وغيرهم) على أساس العمارة المساعد طويلة، مع يماغيج المساعد التوافق 16. أنه يحتوي على أكثر من 140 عمليات لمعالجة الصور واجهة المستخدم الموسعة التي يتم فيها عرض النماذج والبيانات الخام على حدة. ويمكن الاطلاع على شفرة المصدر في https://github.com/mahogny/Endrov. ثالثا، PIVlab، وMأداة ATLAB عن الجسيمات الصور الرقمية velocimetry التي تسمح للمستخدم لكميا ونوعيا تحليل حقول تدفق الجسيمات 17. استخدام هذه البرامج يتطلب ترخيص MATLAB الذي يتضمن أدوات معالجة الصور (http://mathworks.com). PIVlab هو برنامج مصمم لوصف تدفق كميا. وتحسب توزيع سرعة وحجم، الدردورية، الاختلاف، أو القص ضمن أزواج صورة أو سلسلة. لهذا، فإنه عبر يرتبط مناطق صغيرة من الصور (وتسمى 'يمر' في قسم البروتوكول) من الزوج الصورة لاشتقاق النزوح الجسيمات الأكثر احتمالا. هذا الارتباط عبر ينتج مصفوفة الارتباط التي يمكن تحليلها في مجال الفضاء أو التردد باستخدام إما مباشرة عبر ارتباط أو تحول فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس)، على التوالي.
المعدات المستخدمة هنا هي مجهر مقلوب مجهزة نيبكو ('الغزل') القرص، وهو EMCCD، 488 و 561 نانومتر solid- القياسيةليزر الدولة، و20x والهواء أو 40X 60X أو خطة / امزيغ أهداف بالنفط أو الغمر بالمياه. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن أداء الوقت الفاصل بين التصوير مع طرائق التصوير الأخرى، على سبيل المثال، راهنا، line- أو القائم على الليزر المجهر رقة المسح الضوئي، متعدد الفوتون المجهري، وكذلك برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر جنبا إلى جنب مع deconvolution أو منظم إضاءة. وميزة استخدام نظام القرص نيبكو هي الحصول على الصور سريع للغاية، وخاصة إذا وضع تدفق (حركة مستمرة والمسح الضوئي للجسم في البعد ض) هو متاح. بالإضافة إلى ذلك، لتحسين القرار، مكبرة الموسع 1.5 أضعاف أمام EMCCD يمكن استخدامها.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال تتبع الكائن في التنمية ولا سيما تتبع النووي، كان، فإنه من الممكن توضيح الآليات الزخرفة المركزية للC. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني 1،23،24. توسيع هذه الاستراتيجية إلى ارتفاع الإنتاجية، فقد كان من الممكن مؤخرا للكشف عن قواعد الزخرفة إضافية واقتراح ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
