Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em> C. elegans</em> Como usar as ferramentas de código aberto
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Quantitativamente capturar processos de desenvolvimento é crucial para derivar modelos mecanicistas e chave para identificar e descrever os fenótipos mutantes. Aqui são apresentados os protocolos para a preparação de embriões e adultos C. elegans animais para microscopia de lapso de tempo curto e longo prazo e métodos de rastreamento e quantificação dos processos de desenvolvimento. Os métodos apresentados são todos baseados em C. cepas elegans disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis e no software de código aberto que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório independentemente do sistema de microscopia usado. A reconstrução de um modelo de célula-forma 3D usando o IMOD software de modelagem, o rastreamento manual de estruturas subcelulares fluorescente-etiquetados usando o multi-purpose programa de análise de imagem Endrov, e uma análise de fluxo contrátil cortical usando PIVlab (resolvida no tempo Velocimetry Digital Imagem de Partículas Ferramenta para MATLAB) são mostrados. Discute-se como esses métodos também podem ser implantados to quantitativamente capturar outros processos de desenvolvimento em diferentes modelos, por exemplo, rastreamento de linhagem celular e rastreamento, monitoramento do fluxo de vesícula.
Introduction
Com as melhorias estáveis de proteínas fluorescentes, engenharia de genoma, microscopia de luz, e soft e hardware de computador, agora é possível gravar desenvolvimento de muitos organismos modelo em sem precedentes resolução espácio-temporal. Isto permite aos investigadores fazer perguntas que não podem ser abordados anteriormente ou revisitar processos de desenvolvimento conhecidas, a fim de procurar os aspectos negligenciados. Este progresso tem suscitado o campo da biologia do desenvolvimento quantitativo, que visa transformar qualitativos, modelos informais em modelos quantitativos por meio de medições exaustivas e análises estatísticas.
Células de rastreamento e estruturas subcelulares tornou possível derivar modelos quantitativos do desenvolvimento embrionário, atividade do sistema nervoso, ou a divisão celular 1-12. Ao rastrear restos de divisão celular durante o desenvolvimento precoce do C. elegans embrião, poderíamos recentemente revelam que eles seguem um aparelho de somdigitado caminho e constituem fatores de polarização importante 13,14.
Aqui, os protocolos são apresentados que fazem biologia do desenvolvimento quantitativo aproxima acessível para os não-especialistas. O foco recai sobre três straight-forward, ferramentas livremente disponíveis, que são aplicáveis em qualquer laboratório que tem acesso a microscopia confocal padrão e computadores. Estes incluem um protocolo para gerar formas celulares 3D, um protocolo para rastrear restos de divisão celular, e um protocolo para descrever quantitativamente dinâmica actomiosina corticais. O nemátodo C. elegans é usado como um caso exemplar, no entanto, os métodos e ferramentas discutidas aqui são adequadas para uma variedade de questões em outros modelos biológicos, por exemplo, as células cultivadas, explantes de tecido, Organóides ou esferóides, outros embriões, etc.
Geralmente, algumas das análises mostrados aqui também pode ser realizada com a ferramenta aberta fonte populares ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIJI, os "baterias incluídas" versão do ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para os quais muitos plugins para diferentes análises quantitativas estão disponíveis. No entanto, os programas aqui discutidos são projetados para resolver problemas específicos.
Em primeiro lugar, IMOD, um processamento de imagem, modelagem e suite do display pode ser usado para as reconstruções 3D de cortes seriados de elétron ou microscopia de luz 15. IMOD também contém ferramentas para visualizar os dados 3D a partir de qualquer orientação. Em segundo lugar, Endrov, um programa Java projetado para executar análise de imagem, processamento de dados, e anotação de redes ou faixas (entre outros), com base em uma arquitetura de plugins extensa, com ImageJ compatibilidade de encaixe 16. Ele contém mais de 140 operações de processamento de imagem e uma interface de usuário extensível em que modelo e dados brutos são exibidos separadamente. Seu código fonte pode ser encontrada em https://github.com/mahogny/Endrov. Em terceiro lugar, PIVlab, um HAtlab ferramenta para partículas de imagem digital velocimetria que permite que o usuário quantitativa e qualitativamente analisar campos de fluxo de partícula 17. O uso deste programas requer uma licença MATLAB, que inclui a Imagem Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab é um programa desenhado para descrever quantitativamente o fluxo. Ele calcula a distribuição de velocidade, magnitude, vorticidade, divergência ou de cisalhamento dentro de pares de imagens ou séries. Para isso, cross-se correlaciona pequenas áreas de imagens (chamado de "passes" na seção de protocolo) de um par de imagens para derivar o deslocamento de partículas mais provável. Esta correlação cruzada produz uma matriz de correlação que pode ser analisada, no espaço de domínio de frequência ou utilizando qualquer correlação cruzada directa ou uma transformação rápida de Fourier (FFT), respectivamente.
O equipamento utilizado é um microscópio invertido equipado com uma Nipkow ('fiação') do disco, uma EMCCD, 488 e 561 nm padrão sólido-lasers de estado, e 20x ou 40x de ar ou 60x plano / Apochromat objectivos óleo ou água-de imersão. No entanto, é também possível realizar imagem de lapso de tempo com outras modalidades de imagiologia, por exemplo, ponto-, linha- ou microscopia de varrimento de folha à base de laser, microscopia multi-fotão, bem como microscopia de epi-fluorescência combinado com desconvolução ou estruturada iluminação. A vantagem de utilizar um sistema de disco de Nipkow é a aquisição de imagem extremamente rápida, especialmente se um modo de fluxo contínuo (movimento contínuo e de varrimento do objecto na dimensão Z) está disponível. Além disso, para melhorar a resolução, um extensor de aumento de 1,5 vezes na parte dianteira do EMCCD pode ser usado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Através de rastreamento em desenvolvimento objecto, em particular de seguimento nuclear, tem sido possível para elucidar os mecanismos centrais de padronização de C. elegans embriogênese 1,23,24. Expandindo essa estratégia para um maior rendimento, tem sido recentemente possível descobrir regras de padronização adicionais e propor um método para deduzir como padronização regras de novo 10. Para muitos mutantes, no entanto, os defeitos de padrões precisos aind…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
