Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em> C. elegans</em> Açık kaynak Araçlarını Kullanma
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Kantitatif gelişimsel süreçleri yakalayan mutant fenotipleri belirlemek ve tanımlamak için mekanik modelleri ve anahtarı türetmek için çok önemlidir. İşte protokoller embriyo ve yetişkin C hazırlamak için sunulmuştur elegans kısa ve uzun vadeli time-lapse mikroskopi için hayvanlar ve gelişim süreçlerinin takibi ve ölçümü için yöntemler. Sunulan yöntemlerin hepsi C dayanmaktadır kolay kullanılan mikroskop sistemi bağımsız herhangi laboratuvarda uygulanabilir Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden edinilebilir ve açık kaynak yazılımına elegans suşları. Modelleme yazılımı iMod kullanarak 3D hücre şekli modeli bir imar,-floresan etiketli hücre içi yapılar çok amaçlı görüntü analiz programı Endrov ve PIVlab kullanarak kortikal kasılma akışının analizi kullanılarak manuel izleme (Time-Çözülmüş Dijital görüntüleme ölçümleri MATLAB Aracı) gösterilmektedir. Bu t bu yöntemler de dağıtılabilir nasıl tartışıldıo kantitatif vezikül akışının izleme izleme farklı modelleri, örneğin, hücre izleme ve soy diğer gelişimsel süreçleri yakalamak.
Introduction
Floresan proteinleri, genom mühendisliği, ışık mikroskobu ve bilgisayar yumuşak ve donanım sürekli iyileştirmeler ile, benzeri görülmemiş uzay-zamansal çözünürlükte birçok model organizmaların gelişimini kaydetmek artık mümkün. Bu araştırmacılar, daha önce ele olamazdı soru sormak ya da gözden kaçan yönlerini aramak amacıyla bilinen gelişimsel süreçlerini tekrar verir. Bu ilerleme kapsamlı ölçümler ve istatistiksel analizlerle nicel modellere nitel, gayri modelleri dönüştürmeyi amaçlayan niceliksel gelişimsel biyoloji, alanını yol açtı.
Takip hücreleri ve hücre içi yapıların embriyonik gelişim, sinir sistemi aktivitesi ya da hücre bölünmesi 1-12 sayısal modeller elde etmek mümkün kıldı. C. erken gelişimi sırasında hücre bölünmesi kalıntılarını takip ederek elegans embriyo, biz onlar stereo takip ettiklerini ortaya geçenlerde olabiliryolunu yazdığınız ve oluşturan önemli polarize 13,14 faktörleri.
Burada protokoller nicel gelişim biyolojisi olmayan uzmanlar için erişilebilir yaklaşımlar yapmak sunulmuştur. Odak standart konfokal mikroskopi ve bilgisayarlara erişimi olan herhangi bir laboratuvarda uygulanabilir üç düz ileri, serbestçe kullanılabilir araçlar üzerinde yatıyor. Bunlar 3D cep şekiller oluşturmak için bir protokol, hücre bölünmesi kalıntıları izlemek için bir protokol ve kantitatif kortikal actomyosin dinamiklerini açıklamak için bir protokol bulunmaktadır. Nematod C. elegans örnek teşkil eden bir durum olarak kullanılır, bununla birlikte, burada tartışılan yöntem ve araçlar gibi diğer biyolojik örneğin bir model, kültürlenmiş hücreler, doku eksplantlarında, organoids ya da küresel cisimler, için diğer embriyolar, soru çeşitli uygundur
Genel olarak, burada gösterilen analizler bazıları da (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index popüler açık kaynak aracı ImageJ ile gerçekleştirilebilir.html; veya FIJI, farklı kantitatif analizler için birçok eklentileri mevcut olduğu ImageJ sürümünü, http://fiji.sc/Fiji) 'piller dahil'. Ancak, programları burada tartışılan belirli sorunları çözmek için tasarlanmıştır.
İlk olarak, iMod, bir görüntü işleme, modelleme ve görüntü paketi elektron ve ışık mikroskopisi 15 seri bölümlerinin 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılabilir. IMod ayrıca herhangi bir yönlendirme 3D veri görüntüleme için araçlar içerir. İkincisi, Endrov, ImageJ eklenti uyumluluğu 16, ağlar ya da uzun bir eklenti mimarisi temelinde (diğerleri) parça görüntü analizi, veri işleme ve açıklama yapmak için tasarlanmış bir Java programı. 140 üzerinde görüntü işleme operasyonları ve model ve ham veriler ayrı ayrı sergilendiği bir uzayabilir kullanıcı arayüzü içerir. Onun kaynak kodu https://github.com/mahogny/Endrov bulunabilir. Üçüncü olarak, PIVlab bir MNitelik ve nicelik parçacık akış alanları 17 analiz için izin verir dijital parçacık görüntü velosimetri için ATLAB aracı. Bu programların kullanımı İşleme Toolbox (http://mathworks.com) Resmi içeren bir MATLAB lisansı gerektirir. PIVlab kantitatif akışını tanımlamak için tasarlanmış bir programdır. Bu görüntü çift veya seri içindeki hız dağılımı, büyüklüğü, girdap, sapma veya kesme hesaplar. Bunun için, en olası partikül deplasman elde etmek için bir görüntü çiftinin (protokol bölümü olarak adlandırılır 'geçer') görüntülerin küçük alanları çapraz korelasyon göstermektedir. Bu çapraz-korelasyon doğrudan çapraz korelasyon sırasında veya bir hızlı Fourier transformasyonunu (FFT), kullanılarak boşluk veya frekans alanında analiz edilebilir bir ilişkiyi gösteren bir tablo ortaya çıkarır.
Burada kullanılan ekipman Nipkow ('iplik') diske, bir EMCCD, 488 ve 561 nm standart katı-donatılmış bir ters mikroskophal lazerleri ve yağ veya su daldırma hedefleri apochromat 20x hava veya 40x veya 60x planı /. Ancak, diğer görüntüleme yöntemleri ile time-lapse görüntüleme gerçekleştirmek mümkündür, örneğin, nokta-, içini kaplamak veya deconvolution veya yapılandırılmış kombine sac tarama lazer tabanlı mikroskopisi, çoklu foton mikroskopi yanı sıra epi-floresan mikroskopi aydınlatma. Bir Nipkow disk sistemin kullanılmasının avantajı bir akış modu (sürekli hareket ve z boyutunda nesnenin tarama) mevcuttur, özellikle son derece hızlı görüntü elde etme olduğunu. Buna ek olarak, çözünürlüğünü artırmak için, EMCCD önünde bir 1.5 kat büyütme genişletici kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geliştirme izleme nesnesi üzerinden, özellikle de nükleer takibi, bu C merkez desenlendirme mekanizmaları aydınlatmak mümkün olmuştur elegans 1,23,24 Embriyogenez. Yüksek verim için bu stratejiyi genişletilmesi, ek desenlendirme kurallarını ortaya çıkarmak için ve desenlendirme anlamak için nasıl bir yöntem de novo 10 kuralları önermek son zamanlarda mümkün olmuştur. Birçok mutantlar için, ancak, kesin desen kusurları hala bilinmemektedir. Bura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
