Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em> C. elegans</em> Utilizzo strumenti open-source
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Quantitativamente cattura processi di sviluppo è fondamentale per ricavare modelli meccanicistici e la chiave per identificare e descrivere fenotipi mutanti. Qui protocolli sono presentati per la preparazione di embrioni e adulti C. elegans animali per breve e lungo termine microscopia time-lapse e metodi per il monitoraggio e la quantificazione dei processi di sviluppo. I metodi presentati sono tutti basati su C. ceppi disponibili nel Caenorhabditis Genetics Center e sul software open-source elegans che possono essere facilmente implementate in qualsiasi laboratorio indipendentemente dal sistema di microscopia utilizzato. Una ricostruzione di un modello cellulare-forma 3D utilizzando il IMOD software di modellazione, il monitoraggio manuale delle strutture subcellulari fluorescenza marcata con il programma di analisi di immagine multi-purpose Endrov, e un'analisi dei flussi contrattile corticale mediante PIVlab (-Time Risolto Image Velocimetry Particle digitale sono mostrati strumento per MATLAB). Si è discusso di come questi metodi possono anche essere distribuiti to quantitativamente catturare altri processi di sviluppo in diversi modelli, per esempio, di monitoraggio delle cellule e lineage tracing, il monitoraggio del flusso di vescicole.
Introduction
Con i miglioramenti costanti di proteine fluorescenti, ingegneria del genoma, la microscopia ottica, e software e all'hardware, è ora possibile registrare sviluppo di molti organismi modello a risoluzione senza precedenti spazio-temporale. Questo permette ai ricercatori di fare domande che non possono essere affrontate in precedenza o per rivisitare i processi di sviluppo noti per la ricerca di aspetti trascurati. Questo progresso ha scatenato campo della biologia dello sviluppo quantitativo, che mira a trasformare qualitativi, modelli informali in modelli quantitativi da misurazioni approfondite e analisi statistiche.
Tracking cellule e strutture subcellulari ha permesso di ricavare modelli quantitativi dello sviluppo embrionale, l'attività del sistema nervoso, o divisione cellulare 1-12. Tracciando resti divisione cellulare durante lo sviluppo iniziale del C. elegans embrione, potremmo recentemente rivelare che seguono un impianto stereodigitato il percorso e costituiscono importanti fattori di polarizzazione 13,14.
Qui, i protocolli vengono presentate che rendono la biologia dello sviluppo quantitativo approcci accessibili per i non esperti. L'attenzione si concentra su tre straight-forward, strumenti liberamente disponibili che sono implementabili in qualsiasi laboratorio che ha accesso a microscopia confocale standard ed i computer. Tra questi, un protocollo per generare forme di cellule 3D, un protocollo per monitorare resti divisione cellulare, e un protocollo per descrivere quantitativamente le dinamiche actomyosin corticali. Il nematode C. elegans è usato come un caso esemplare, tuttavia, i metodi e gli strumenti qui descritti adatti per una serie di domande in altri modelli biologici, per esempio, cellule coltivate, espianti di tessuto, organoidi o sferoidi, altri embrioni, etc.
In generale, alcune delle analisi indicati qui possono essere eseguite anche con il popolare strumento di ImageJ open source (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, le "batterie incluse 'versione di ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) per i quali sono disponibili molti plugin per diversi analisi quantitative. Tuttavia, i programmi qui discussi sono progettati per affrontare i problemi specifici.
In primo luogo, MDI, l'elaborazione delle immagini, la modellazione e le suite display può essere utilizzato per le ricostruzioni 3D di sezioni seriali di elettrone o microscopia ottica 15. IMOD contiene anche strumenti per la visualizzazione dei dati 3D da qualsiasi orientamento. In secondo luogo, Endrov, un programma Java progettato per eseguire l'analisi delle immagini, l'elaborazione dei dati, e l'annotazione di reti o brani (tra gli altri), sulla base di una architettura a plugin esteso, con ImageJ compatibilità plug-16. Esso contiene più di 140 operazioni di elaborazione delle immagini e un'interfaccia utente estendibile, in cui il modello ei dati grezzi vengono visualizzati separatamente. Il suo codice sorgente può essere trovato alla https://github.com/mahogny/Endrov. In terzo luogo, PIVlab, un MStrumento Atlab per particella digitale immagine velocimetria, che permette all'utente di analizzare quantitativamente e qualitativamente i campi di flusso di particelle 17. L'utilizzo di questo programma richiede una licenza MATLAB che include l'Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab è un programma progettato per descrivere quantitativamente il flusso. Calcola la distribuzione di velocità, ampiezza, vorticità, divergenza, o tranciare in coppie di immagini o serie. Per questo, cross-correla piccole aree di immagini (chiamati 'pass' nella sezione protocollo) di una coppia di immagini per ricavare lo spostamento delle particelle più probabile. Questa correlazione incrociata produce una matrice di correlazione che può essere analizzato nel dominio spaziale o la frequenza utilizzando cross-correlazione diretta o una trasformazione rapida di Fourier (FFT), rispettivamente.
L'apparecchiatura utilizzata è un microscopio rovesciato dotato di Nipkow ('spinning') del disco, un EMCCD, 488 e 561 nm solido-serielaser a stato, e 20x o 40x o aria 60x piano / apochromat obiettivi di petrolio o di acqua-immersion. Tuttavia, è anche possibile effettuare l'imaging time-lapse con altre modalità di imaging, ad esempio, point, LINE o laser-based microscopia foglio di scansione, microscopia multi-fotoni, così come la microscopia fluorescenza combinata con deconvoluzione o strutturato illuminazione. Il vantaggio di utilizzare un sistema a disco Nipkow è l'acquisizione immagine estremamente veloce, specialmente se una modalità di streaming (movimento continuo e scansione dell'oggetto nella dimensione z) è disponibile. Inoltre, per migliorare la risoluzione, un ingrandimento di 1,5 volte extender davanti alla EMCCD può essere utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attraverso oggetto inseguimento in sviluppo, in particolare inseguimento nucleare, è stato possibile per chiarire i meccanismi centrali di patterning C. elegans embriogenesi 1,23,24. Espansione questa strategia per un throughput più elevato, è stato recentemente possibile scoprire regole patterning complementari e di proporre un metodo come dedurre patterning regole de novo 10. Per molti mutanti, tuttavia, l'esatto difetto patterning sono ancora sconosciute. I metodi qui de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
