Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
כמותית לכידת תהליכים התפתחותיים היא חיונית כדי להפיק מודלים ומפתח מכניסטית לזהות ולתאר פנוטיפים מוטציה. כאן פרוטוקולים מוצגים להכנת עוברים וג הבוגר elegans בעלי חיים למיקרוסקופיה זמן לשגות טווח קצר וארוך ושיטות למעקב וכימות של תהליכים התפתחותיים. כל השיטות שהוצגו מבוססות על ג זנים זמינים במרכז לגנטיקת Caenorhabditis ועל תוכנת קוד פתוח elegans שניתן ליישם בקלות בכל מעבדה עצמאית של מערכת מיקרוסקופיה בשימוש. בנייה מחדש של מודל תא-צורת 3D באמצעות IMOD תוכנת דוגמנות, (velocimetry תמונה דיגיטלי חלקיקים זמן נפתר מעקב ידני של מבני subcellular fluorescently שכותרתו באמצעות התכנית רב תכליתי ניתוח תמונת Endrov, וניתוח של זרימת התכווצות בקליפת המוח באמצעות PIVlab כלי לMATLAB) מוצג. הוא דן כיצד גם ניתן לפרוס שיטות אלה לאo ללכוד כמותית תהליכים התפתחותיים אחרים בדגמים שונים, לדוגמא, מעקב תא ושושלת ההתחקות, מעקב של זרימת שלפוחית.
עם השיפורים מתמידים של חלבוני ניאון, הנדסה גנטית, מיקרוסקופ אור, ורך מחשב וחומרה, עכשיו זה אפשרי להקליט פיתוח של אורגניזמים מודל רבים ברזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. הדבר מאפשר לחוקרים לשאול שאלות שלא ניתן לטפל בעבר או לבקר תהליכים התפתחותיים ידועים כדי לחפש את היבטים התעלמו. התקדמות זו עוררה את תחום הביולוגיה התפתחותית כמותיים, שמטרתה להפוך את הדגמים איכותיים, פורמליים למודלים כמותיים על ידי מדידות יסודיות וניתוחים סטטיסטיים.
תאי מעקב ומבני subcellular הפכו אותו ניתן להפיק מודלים כמותיים של התפתחות עוברית, פעילות מערכת עצבים, או תא חלוקה 1-12. על ידי מעקב אחר שרידי חלוקת התא במהלך ההתפתחות המוקדמת של ג עובר elegans, אנו יכולים לחשוף לאחרונה שהם בצעו סטריאוקיטוב חשוב הקליד נתיב ומהווה גורמי 13,14.
הנה, פרוטוקולים מוצגים שהופכים את הביולוגיה התפתחותית כמותיים גישות נגישות לאינם מומחים. המוקד נמצא על שלושה כלים ישר קדימה, זמינים באופן חופשי כי הם ישימים בכל מעבדה יש לו גישה למיקרוסקופיה confocal סטנדרטית ומחשבים. אלה כוללים פרוטוקול כדי ליצור צורות תא 3D, פרוטוקול כדי לעקוב אחר שרידי חלוקת תא, ופרוטוקול לתאר כמותית דינמיקת actomyosin קליפת המוח. נמטודות ג elegans משמש כמקרה למופת, לעומת זאת, השיטות וכלים שנדונו כאן הם מתאימות למגוון רחב של שאלות במודלים אחרים ביולוגיים, למשל, תאים בתרבית, explants רקמות, organoids או spheroids, עוברים אחרים, וכו '
בדרך כלל, חלק מהניתוחים המוצגים כאן יכול גם להתבצע עם ImageJ כלי הקוד פתוח הפופולרי (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; או פיג'י, "הסוללות כלולות" גרסה של ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) שלתוספים רבים לניתוחים כמותיים שונים זמינים. עם זאת, התוכניות שנדונו כאן נועדו להתמודד עם בעיות ספציפיות.
ראשית, IMOD, עיבוד תמונה, דוגמנות וחבילת תצוגה יכולים לשמש לשחזורי 3D סעיפים סדרתי מאלקטרון או מיקרוסקופ אור 15. IMOD מכיל גם כלים להצגת נתוני 3D מכל כיוון. שנית, Endrov, תכנית Java נועדה לבצע ניתוח תמונה, עיבוד נתונים, וביאור של רשתות או רצועות (בין יתר) על בסיס ארכיטקטורת תוסף מורחב, עם תאימות תוסף ImageJ 16. הוא מכיל מעל 140 פעולות עיבוד תמונה וממשק משתמש להרחבה שבמודל והנתונים גולמיים מוצגים בנפרד. ניתן למצוא את קוד המקור שלה בhttps://github.com/mahogny/Endrov. שלישית, PIVlab, Mכלי ATLAB לvelocimetry תמונת חלקיק דיגיטלי המאפשר למשתמש כמותית ואיכותי לנתח זרימת חלקיקי שדות 17. השימוש בתוכניות זה טעון רישוי MATLAB הכולל עיבוד תמונת ארגז כלים (http://mathworks.com). PIVlab היא תכנית שנועדה לתאר זרימת כמותית. היא מחשבת את חלוקת מהירות, גודל, ערבוליות, סטייה, או הגזירה בתוך זוגות תמונה או סדרה. לשם כך, בין-קורלציה אזורים קטנים של תמונות ('עובר' בשם בסעיף הפרוטוקול) של צמד תמונה לגזור את עקירת חלקיקים הסבירה ביותר. חוצה קשר זה מניב מטריצת מתאם שניתן לנתח בתחום החלל או תדירות או באמצעות מתאם צולב ישיר או שינוי פורייה מהיר (FFT), בהתאמה.
הציוד המשמש כאן הוא מיקרוסקופ הפוך מצויד בניפקוב ("ספינינג") דיסק, EMCCD, 488 ומוצק 561 ננומטר סטנדרטילייזרים של מצב, ו20x אוויר או 40x או 60x תכנית / Apochromat מטרות נפט או מים טבילה. עם זאת, אפשר גם לבצע הדמיה הזמן לשגות עם שיטות הדמיה אחרות, למשל, על נקודה, סכן למעשה או מיקרוסקופיה גיליונות סריקה מבוססת לייזר, מיקרוסקופיה רב-פוטון, כמו גם במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית בשילוב עם deconvolution או מובנה תְאוּרָה. היתרון של שימוש במערכת דיסק ניפקוב הוא רכישת תמונה מאוד מהר, במיוחד אם מצב הזרמה (תנועה וסריקה של האובייקט בממד z רציף) זמין. בנוסף, כדי לשפר את הרזולוציה, ניתן להשתמש במאריך מגדלת פי 1.5 מול EMCCD.
באמצעות מעקב אחר אובייקט בפיתוח, במעקב גרעיני מסוים, זה כבר אפשרי להבהיר מנגנוני דפוסים מרכזיים של ג elegans עובר 1,23,24. הרחבת אסטרטגיה זו לתפוקה גבוהה יותר, זה כבר אפשרי לאחרונה לחשוף כללי דפוסים נוספים ולהציע שיטה איך להסיק דפוסים שולטת דה נובו 10. ל?…
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
20 µm | |||
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
0.1 µm | |||
Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |