Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Количественно захвата процессы развития имеет решающее значение для получения механистической модели и ключ для идентификации и описания мутантных фенотипов. Здесь представлены протоколы для подготовки эмбрионов и взрослых С Элеганс животных для кратко- и долгосрочного покадровой микроскопии и методы для отслеживания и количественной оценки процессов развития. Методы, представленные основаны на С. штаммы Элеганс, доступные в Caenorhabditis генетический центр и на программное обеспечение с открытым исходным кодом, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории независимо от системы, используемой микроскопии. Реконструкция модели сотового формы 3D с помощью моделирования программного обеспечения УПМ, руководство отслеживания флуоресцентно-меченых субклеточных структур с помощью программы анализа изображений многоцелевой Endrov и анализ корковой потока сократительной используя PIVlab (времяразрешенная Измерение скорости частиц изображения цифровой Инструмент для MATLAB) показаны. Это обсуждается, как эти способы могут быть развернуты тО количественном захватить другие процессы развития в различных моделях, например, отслеживания клеток и рода трассировки, отслеживание пузырьков потока.
С стабильное улучшение флуоресцентных белков, генной инженерии, световой микроскопии и компьютерного программного и аппаратного обеспечения, теперь можно записать развитие многих организмов модели с беспрецедентной пространственно-временным разрешением. Это позволяет исследователям задавать вопросы, которые не могут быть рассмотрены ранее или вновь известные процессы развития в целях поиска недооцененных аспектов. Этот прогресс вызвал поле количественного биологии развития, которая направлена на преобразование качественные, неформальные модели в количественных моделей по капитальному измерений и статистического анализа.
Отслеживание клетки и субклеточные структуры позволило вывести количественные модели эмбрионального развития, деятельности нервной системы, или клеточного деления 1-12. Отслеживая деление клеток остатки в начале развития C. Элеганс эмбрионов, мы могли недавно показали, что они следуют стереонабрали путь и составляют важный поляризационный факторы 13,14.
Здесь представлены протоколы, которые делают количественный биологии развития подходов доступны для неспециалистов. В центре внимания лежит на трех прямо вперед, свободно доступных инструментов, которые осуществимыми в любой лаборатории, имеющей доступ к стандартной конфокальной микроскопии и компьютеров. Они включают в себя протокол для создания 3D-клеточные формы, протокол для отслеживания деление клеток остатки, и протокол количественно описать динамику корковых актомиозин. Нематода C. Элеганс используется в качестве иллюстративного случае, однако, методы и средства, рассмотренные здесь, подходит для различных вопросов в других биологических моделей, например, культивируемые клетки, ткани эксплантатов, органоидам или сфероидов, других эмбрионов и т.д.
Вообще, некоторые из анализов, показанных здесь также может быть выполнена с помощью популярного инструмента ImageJ с открытым исходным кодом (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.HTML; или Фиджи, "включенные батареи" версию ImageJ, http://fiji.sc/Fiji~~HEAD=dobj), для которых многие плагины для различных количественного анализа доступны. Тем не менее, программы обсуждаются здесь предназначены для решения конкретных проблем.
Во-первых, УПМ, обработки изображения, моделирование и отображение люкс может быть использован для реконструкции 3D серийных срезов из электрона или световой микроскопии 15. УПМ также содержит инструменты для просмотра 3D-данные из любой ориентации. Во-вторых, Endrov, программа Java, предназначены для выполнения анализа изображения, обработку данных и аннотацию сетей или дорожек (среди прочих) на основе расширенной архитектуры плагина, с совместимостью плагина ImageJ 16. Она содержит более 140 операций обработки изображений и расширяемую пользовательский интерфейс, в котором модель и исходные данные отображаются отдельно. Ее исходный код можно найти на https://github.com/mahogny/Endrov. В-третьих, PIVlab, А МATLAB инструмент для изображения велосиметрии цифровой частиц, что позволяет пользователю количественно и качественно проанализировать поля течения частиц 17. Использование этой программы требует лицензии MATLAB, которая включает изображение Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab это программа, предназначенная для количественного описания потока. Он рассчитывает распределение скоростей, величины, вихря, расхождение или сдвига в течение пары изображений или серии. Для этого кросс-коррелирует небольшие участки изображения (называемые путевок "в разделе протокола) в пары изображений для получения наиболее вероятного перемещения частиц. Это кросс-корреляция дает корреляционную матрицу, который может быть проанализированы в домене пространства или частоты, используя либо прямой кросс-корреляции или быстрого преобразования Фурье (БПФ), соответственно.
Оборудование, используемое здесь является инвертированный микроскоп оснащен Нипкова ('') прядильной диска, на EMCCD, 488 и 561 нм стандарт твердое телолазеры, и 20x воздуха или 40x или 60x план / апохромат масляной или водной погружения целей. Тем не менее, это также возможно выполнить покадровой обработки с другими методами визуализации, например, точечно, line- или лист-сканирующей лазерной микроскопии на основе, многофотонной микроскопии, а также эпи-флуоресцентной микроскопии в сочетании с деконволюции или структурированным освещение. Преимущество использования системы Нипкова диска является чрезвычайно быстро захвата изображений, особенно если потоковый режим (непрерывное движение и сканирование объекта в измерении г) доступен. Кроме того, для улучшения разрешения, в 1,5 раза увеличительное удлинитель перед EMCCD могут быть использованы.
Через объекта слежения в развитии, в частности ядерной слежения, стало возможным выяснить центральные механизмы формирования паттерна С. Элеганс эмбриогенеза 1,23,24. Расширение этой стратегии в более высокой пропускной способности, это было недавно можно раскрыть дополнител…
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
20 µm | |||
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
0.1 µm | |||
Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |