में विकास की प्रक्रिया पर नज़र रखने और बढ़ाता<em> सी। एलिगेंस</em> खुले स्रोत उपकरण का उपयोग
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
मात्रात्मक विकास की प्रक्रिया पर कब्जा उत्परिवर्ती phenotypes की पहचान करने और वर्णन करने के लिए यंत्रवत मॉडल और कुंजी को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ प्रोटोकॉल भ्रूण और वयस्क सी तैयारी के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं एलिगेंस छोटी और लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए जानवरों और विकास की प्रक्रिया की ट्रैकिंग और मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों। प्रस्तुत तरीकों सभी सी के आधार पर कर रहे हैं आसानी से इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी प्रणाली की स्वतंत्र रूप से किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है कि Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र से उपलब्ध है और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पर एलिगेंस उपभेदों। मॉडलिंग सॉफ्टवेयर IMOD का उपयोग कर एक 3 डी सेल आकार मॉडल की एक पुनर्निर्माण,-fluorescently लेबल subcellular संरचनाओं बहुउद्देश्यीय छवि विश्लेषण कार्यक्रम Endrov, और PIVlab का उपयोग cortical सिकुड़ा प्रवाह के एक विश्लेषण का उपयोग करने का मैनुअल ट्रैकिंग (समय हल डिजिटल कण छवि velocimetry MATLAB के लिए उपकरण) दिखाए जाते हैं। यह टी इन तरीकों में भी तैनात किया जा सकता है कि कैसे चर्चा की हैओ मात्रात्मक पुटिका प्रवाह की ट्रैकिंग, ट्रेसिंग अलग अलग मॉडल, जैसे, सेल ट्रैकिंग और वंश में अन्य विकास की प्रक्रिया पर कब्जा।
Introduction
फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जीनोम इंजीनियरिंग, प्रकाश माइक्रोस्कोपी, और कंप्यूटर नरम और हार्डवेयर के स्थिर सुधार के साथ, यह अभूतपूर्व spatio- लौकिक संकल्प पर कई मॉडल जीवों के विकास के रिकॉर्ड करने के लिए अब संभव है। यह शोधकर्ताओं पहले से संबोधित नहीं किया जा सकता है कि सवाल पूछने के लिए या अनदेखी पहलुओं के लिए खोज करने के क्रम में जाना जाता है विकास की प्रक्रिया को फिर से आना अनुमति देता है। इस प्रगति को पूरी तरह से माप और सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा मात्रात्मक मॉडल में गुणात्मक, अनौपचारिक मॉडल बदलने के लिए करना है जो मात्रात्मक विकास जीव विज्ञान के क्षेत्र छिड़ गया है।
ट्रैकिंग कोशिकाओं और subcellular संरचनाओं भ्रूण विकास, तंत्रिका तंत्र गतिविधि, या कोशिका विभाजन 1-12 की मात्रात्मक मॉडल प्राप्त करने के लिए यह संभव बना दिया है। सी के प्रारंभिक विकास के दौरान कोशिकाओं के विभाजन के अवशेष पर नज़र रखने से एलिगेंस भ्रूण, हम वे एक स्टीरियो पालन पता चलता है कि हाल ही में कर सकता हैपथ टाइप और गठन में महत्वपूर्ण ध्रुवीकरण 13,14 कारकों।
इधर, प्रोटोकॉल मात्रात्मक विकास जीव विज्ञान गैर विशेषज्ञों के लिए सुलभ बनाने के दृष्टिकोण है कि प्रस्तुत कर रहे हैं। फोकस मानक confocal माइक्रोस्कोपी और कंप्यूटर के लिए उपयोग किया है कि किसी भी प्रयोगशाला में लागू कर रहे हैं कि तीन सीधे आगे, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरणों पर स्थित है। ये 3 डी सेल आकार उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल, कोशिका विभाजन के अवशेष को ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल, और मात्रात्मक cortical actomyosin गतिशीलता का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल हैं। निमेटोड सी एलिगेंस एक अनुकरणीय मामले के रूप में प्रयोग किया जाता है, हालांकि, यहाँ पर चर्चा के तरीकों और उपकरणों आदि अन्य जैविक जैसे मॉडल, संवर्धित कोशिकाओं, ऊतक explants, organoids या spheroids, दूसरे भ्रूण में सवालों की एक किस्म के लिए अनुकूल हैं
आम तौर पर, यहाँ दिखाया विश्लेषण के कुछ भी (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index लोकप्रिय खुला स्रोत उपकरण ImageJ के साथ किया जा सकता है।एचटीएमएल; या फिजी, अलग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कई plugins उपलब्ध हैं, जिसके लिए ImageJ के संस्करण, http://fiji.sc/Fiji) 'बैटरी शामिल'। हालांकि, कार्यक्रमों यहाँ पर चर्चा की विशिष्ट समस्याओं से निपटने के लिए तैयार कर रहे हैं।
सबसे पहले, IMOD, एक छवि प्रसंस्करण, मॉडलिंग और प्रदर्शन सूट इलेक्ट्रॉन या प्रकाश माइक्रोस्कोपी 15 से धारावाहिक वर्गों के 3D पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। IMOD भी किसी भी अभिविन्यास से 3 डी डेटा को देखने के लिए उपकरण शामिल हैं। दूसरे, Endrov, ImageJ प्लगइन संगतता 16 के साथ, नेटवर्क या एक विस्तारित प्लगइन वास्तुकला के आधार पर (दूसरों के बीच) पटरियों की छवि विश्लेषण, डाटा प्रोसेसिंग, और एनोटेशन प्रदर्शन करने के लिए बनाया गया एक जावा प्रोग्राम। यह 140 से अधिक छवि प्रसंस्करण संचालन और मॉडल और कच्चे डेटा अलग से प्रदर्शित कर रहे हैं जिसमें एक विस्तृत यूजर इंटरफेस में शामिल है। इसके स्रोत कोड https://github.com/mahogny/Endrov पर पाया जा सकता है। तीसरा, PIVlab, एक एममात्रात्मक और गुणात्मक कण प्रवाह क्षेत्र 17 का विश्लेषण करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है कि डिजिटल कण छवि velocimetry के लिए ATLAB उपकरण। इस प्रोग्राम का उपयोग प्रसंस्करण उपकरण बॉक्स (http://mathworks.com) छवि भी शामिल है कि एक MATLAB लाइसेंस की आवश्यकता है। PIVlab मात्रात्मक प्रवाह का वर्णन करने के लिए कार्यक्रम तैयार किया है। यह छवि जोड़े या श्रृंखला के भीतर वेग वितरण, परिमाण, vorticity, विचलन, या कतरनी खरीदते हैं। इस के लिए, यह सबसे संभावित कण विस्थापन प्राप्त करने के लिए एक छवि जोड़ी की (प्रोटोकॉल अनुभाग में 'नामक गुजरता') छवियों के छोटे क्षेत्रों पार संबद्ध। इस पार से संबंध प्रत्यक्ष पार से संबंध या क्रमश: एक तेजी से फूरियर परिवर्तन (FFT), या तो उपयोग अंतरिक्ष या आवृत्ति डोमेन में विश्लेषण किया जा सकता है कि एक संबंध मैट्रिक्स अर्जित करता है।
यहां इस्तेमाल किया उपकरण एक Nipkow ('कताई') डिस्क, एक EMCCD, 488 और 561 एनएम मानक ठोस के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप हैराज्य पराबैंगनीकिरण, और तेल या पानी विसर्जन उद्देश्यों apochromat 20x हवा या 40x या 60x योजना /। हालांकि, यह अन्य इमेजिंग तौर तरीकों के साथ समय व्यतीत इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए भी संभव है, जैसे, point-, लाइन- या deconvolution या संरचित के साथ संयुक्त चादर स्कैनिंग लेजर आधारित माइक्रोस्कोपी, बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी, साथ ही महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रोशनी। एक Nipkow डिस्क प्रणाली का उपयोग करने का लाभ यह है कि एक स्ट्रीमिंग मोड (निरंतर आंदोलन और z आयाम में वस्तु की स्कैनिंग) उपलब्ध है, खासकर अगर बहुत तेजी से छवि अधिग्रहण है। इसके अलावा, संकल्प में सुधार करने के लिए, EMCCD के सामने एक 1.5 गुना आवर्धक भरनेवाला इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विकास में ट्रैकिंग वस्तु के माध्यम से, विशेष रूप से परमाणु ट्रैकिंग में, यह सी के मध्य patterning के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए संभव हो गया है एलिगेंस 1,23,24 embryogenesis। उच्च throughput के लिए इस रणनीति का विस्तार, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
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