Sporing og Kvantifisering utviklingsprosesser i<em> C. elegans</em> Ved hjelp av Open-source verktøy
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Kvantitativt fange utviklingsprosesser er avgjørende for å utlede mekanistiske modeller og nøkkelen til å identifisere og beskrive mutante fenotyper. Her protokoller presenteres for å forberede embryoer og voksen C. elegans dyr for kort- og langsiktig time-lapse mikroskopi og metoder for sporing og kvantifisering av utviklingsprosesser. Metodene som presenteres er alle basert på C. elegans stammer tilgjengelige fra Caenorhabditis Genetics Center og på åpen kildekode programvare som enkelt kan implementeres i alle laboratorie uavhengig av mikros systemet som brukes. En rekonstruksjon av en 3D-celle-form modellen ved hjelp av modellering programvare IMOD, manuell sporing av fluoresceinmerkede subcellulære strukturer ved hjelp av multi-purpose bildeanalyse program Endrov, og en analyse av kortikal kontraktile strømmer med PIVlab (Time-Løst Digital Particle Bilde velocimetry verktøy for MATLAB) vises. Det diskuteres hvordan disse metodene kan også distribueres to kvantitativt fange andre utviklingsprosesser i ulike modeller, for eksempel, celle sporing og avstamning sporing, sporing av vesikkel flyt.
Introduction
Med de stadige forbedringer av fluorescerende proteiner, genom prosjektering, lysmikroskopi, og data soft- og hardware, er det nå mulig å registrere utviklingen av mange modellorganismer ved enestående rom-tid-oppløsning. Dette gjør forskerne å stille spørsmål som ikke kunne tas opp tidligere eller å revidere kjente utviklingsprosesser for å søke etter oversett aspekter. Denne utviklingen har skapt innen kvantitativ utviklingsbiologi, som tar sikte på å trans kvalitative, uformelle modeller i kvantitative modeller av grundige målinger og statistiske analyser.
Sporing av celler og subcellulære strukturer har gjort det mulig å utlede kvantitative modeller for embryoutvikling, nervesystem-aktivitet, eller celledeling 1-12. Ved å spore celledeling rester under tidlig utvikling av C. elegans embryo, vi kunne nylig avsløre at de følger en stereoskrev banen og utgjør viktig polariserende faktorer 13,14.
Her blir protokoller presenteres som gjør kvantitative utviklingsbiologi tilnærminger tilgjengelig for ikke-eksperter. Fokuset ligger på tre rett fram, fritt tilgjengelige verktøy som er gjennomfør i noen lab som har tilgang til standard konfokalmikroskopi og datamaskiner. Disse inkluderer en protokoll for å generere 3D-celleformer, en protokoll for å spore celledeling rester, og en protokoll for å kvantitativt beskrive kortikale actomyosin dynamikk. Den nematode C. elegans er brukt som et eksempel tilfellet er imidlertid de metoder og verktøy behandlet her, er egnet for en rekke spørsmål i andre biologiske modeller, for eksempel, dyrkede celler, vev eksplantater, organoids eller sfæroider Embryoer andre, etc.
Vanligvis noen av analysene er vist her kan også utføres med den populære open source verktøy ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; eller FIJI, de 'batterier inkludert' versjon av ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) hvor mange plugins for ulike kvantitative analyser er tilgjengelige. Imidlertid programmene diskutert her, er utformet for å håndtere spesifikke problemer.
For det første, IMOD, et bildebehandlings, modellering og visnings pakke kan benyttes for 3D-rekonstruksjoner av seriesnitt fra elektron eller lysmikroskopi 15. IMOD inneholder også verktøy for visning av 3D-data fra alle retninger. Dernest Endrov, et Java-program utviklet for å utføre bildeanalyse, databehandling, og annotering av nettverk eller spor (blant annet) på grunnlag av en utvidet plugin arkitektur, med ImageJ plugin kompatibilitet 16. Den inneholder over 140 bildebehandlingsoperasjoner og en utvidbar brukergrensesnitt som modell og rådata vises separat. Kildekoden finner du på https://github.com/mahogny/Endrov. For det tredje, PIVlab, en MATLAB verktøy for digital partikkel bilde velocimetry som tillater brukeren å kvantitativt og kvalitativt analysere partikkelstrømmer felt 17. Bruken av dette programmer krever en MATLAB lisens som inkluderer Bildebehandling Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab er et program utviklet for å kvantitativt beskrive flyten. Den beregner hastighetsfordeling, størrelse, virvling, divergens, eller skjær innenfor bilde par eller serier. For dette, det cross-korrelerer små områder av bildene (kalt 'pasninger "i protokollen delen) av et bilde paret å utlede den mest sannsynlige partikkel fortrengning. Dette krysskorrelasjon gir en korrelasjonsmatrise som kan analyseres i rommet eller i frekvensdomenet ved å bruke enten direkte krysskorrelasjon eller en hurtig Fourier transformasjon (FFT), henholdsvis.
Utstyret som brukes her er en invertert mikroskop utstyrt med en Nipkow ('spinner') plate, en EMCCD, 488 og 561 nm standard solid-state laser og 20x luft eller 40x eller 60x plan / apochromat olje- eller vannrednings målsettinger. Det er imidlertid også mulig å utføre time-lapse avbildning med andre bildediagnostikk, f.eks punkt-, linje- eller ark-scanning laser-baserte mikroskopi, multi-foton mikroskopi, samt epi-fluorescens mikroskopi i kombinasjon med dekonvolusjon eller strukturert belysning. Fordelen med å bruke en Nipkow plate system er ekstremt rask bildeoverføring, spesielt hvis en streaming-modus (kontinuerlig bevegelse og scanning av objektet i z dimensjon) er tilgjengelig. I tillegg, for å forbedre oppløsning, kan en 1,5 ganger forstørrende ekstender foran EMCCD benyttes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gjennom objektsporings i utvikling, spesielt kjernesporing, har det vært mulig å klargjøre sentrale mønstrings mekanismer C. elegans embryogenese 1,23,24. Utvide denne strategien til høyere gjennomstrømning, har det nylig blitt mulig å avdekke flere mønstringsregler og å foreslå en metode for hvordan å utlede mønster regler de novo 10. For mange mutanter, men de nøyaktige mønstrings mangler er fortsatt ukjent. Metodene som beskrives her er verktøy som kan være medv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
