Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em> C. elegans</em> Använda Open-source-verktyg
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Kvantitativt fånga utvecklingsprocesser är avgörande för att härleda mekanistiska modeller och för att identifiera och beskriva muterade fenotyper. Här protokoll presenteras för framställning av embryon och vuxna C. elegans djur för kort och lång sikt time-lapse mikroskopi och metoder för spårning och kvantifiering av utvecklingsprocesser. De metoder som presenteras är baserade på C. elegans stammar tillgängliga från Caenorhabditis Genetics Center och på öppen källkod som kan enkelt implementeras i alla laboratorier oberoende av mikroskopi system som används. En rekonstruktion av en 3D-cell-form modellen med modellering programvara IMOD, manuell spårning av fluorescerande-märkta subcellulära strukturer med hjälp av multi-purpose bildanalysprogram Endrov, samt en analys av kortikal kontraktila flödet med PIVlab (Tids Lösta Digital Particle Image Velocimetry Verktyg för MATLAB) visas. Det diskuteras hur dessa metoder kan också sättas to kvantitativt fånga andra utvecklingsprocesser i olika modeller, till exempel spårning cell och härstamning spåra, spårning av vesikler flödet.
Introduction
Med ständiga förbättringar av fluorescerande proteiner, genomteknik, ljusmikroskop, och dator mjuk- och hårdvara, är det nu möjligt att registrera utvecklingen av många modellorganismer vid oöverträffad spatiotemporala upplösning. Detta gör det möjligt för forskare att ställa frågor som inte kunde behandlas tidigare eller att se över kända utvecklingsprocesser för att söka efter förbisedda aspekterna. Denna utveckling har väckt inom kvantitativ utvecklingsbiologi, som syftar till att omvandla kvalitativa, informella modeller i kvantitativa modeller med noggranna mätningar och statistiska analyser.
Spårnings celler och subcellulära strukturer har gjort det möjligt att härleda kvantitativa modeller av embryonal utveckling, nervsystemets aktivitet, eller celldelning 1-12. Genom att spåra celldelning rester under tidig utveckling av C. elegans embryo, vi kunde nyligen avslöja att de följer en stereoskrivit bana och utgör viktiga polariserande faktorer 13,14.
Här är protokoll presenteras som gör kvantitativ utvecklingsbiologi närmar sig tillgänglig för icke-experter. Fokus ligger på tre raka framåt, fritt tillgängliga verktyg som är genomförbara i alla lab som har tillgång till standard konfokalmikroskopi och datorer. Dessa inkluderar ett protokoll för att generera 3D cellformer, ett protokoll för att spåra celldelning rester, och ett protokoll för att kvantitativt beskriva kortikala aktomyosin dynamik. Nematoden C. elegans används som ett exemplifierande fall är emellertid de metoder och verktyg som diskuteras här är lämpade för en mängd olika frågor i andra biologiska modeller, t.ex. odlade celler, vävnadsexplantat, organoids eller sfäroider, andra embryon, etc.
Generellt kan en del av de analyser som visas här också utföras med den populära öppen källkod verktyg ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; eller FIJI, "ingår batterier" den version av ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) för vilka många plugins för olika kvantitativa analyser finns tillgängliga. Men programmen diskuteras här är utformade för att ta itu med särskilda problem.
För det första, IMOD, en bildbehandling, modellering och display sviten kan användas för 3D rekonstruktioner av seriesnitt från elektronmikroskopi eller ljusmikroskop 15. IMOD innehåller också verktyg för att titta på 3D-data från alla riktningar. För det andra Endrov, ett Java-program för att utföra bildanalys, databehandling och anteckning av nätverk eller spår (bland annat) på grundval av en utökad plugin arkitektur, med ImageJ plugin kompatibilitet 16. Den innehåller över 140 bild behandling och en utbyggbar användargränssnitt i vilken modell och rådata visas separat. Dess källkod kan hittas på https://github.com/mahogny/Endrov. För det tredje, PIVlab, en MATLAB verktyg för digital partikelbild Velocimetry som tillåter användaren att kvantitativt och kvalitativt analysera partikelflödesfält 17. Användningen av detta program krävs en MATLAB licens som innehåller Bildbehandling Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab är ett program för att kvantitativt beskriva flödet. Det beräknar hastighetsfördelningen, storlek, vorticitet, divergens, eller klippa inom bildpar eller serier. För detta kors korrelerar det små områden av bilder (kallade passningar "i protokollenheten) i en bild par att härleda den mest sannolika partikel förskjutning. Denna korskorrelation ger en korrelationsmatris som kan analyseras i utrymmet eller frekvensdomänen med hjälp av antingen direkt korskorrelation eller en snabb Fouriertransformation (FFT), respektive.
Den utrustning som används här är ett inverterat mikroskop utrustat med en Nipkow ("spinning") skiva, en EMCCD, 488 och 561 nm standard fast-tillståndslasrar och 20x luft eller 40x eller 60x planen / Apochromat olje- eller vatten nedsänkning mål. Emellertid är det även möjligt att utföra tidsförlopp avbildning med andra avbildningsmodaliteter, t.ex. punkt-, linje- eller ark-avsökningslaserbaserad mikroskopi, multifoton mikroskopi samt epi-fluorescensmikroskopi kombinerad med dekonvolution eller strukturerad belysning. Fördelen med att använda ett Nipkow skivsystemet är den extremt snabb bildförvärv, särskilt om en strömmande mod (kontinuerlig rörelse och avsökning av objektet i z-dimensionen) är tillgänglig. Dessutom, för att förbättra upplösningen, kan en 1,5-faldig förstorings förlängare framför EMCCD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genom objektspårning i utveckling, i synnerhet kärnkrafts spårning, har det varit möjligt att klarlägga centrala mönstrings mekanismer för C. elegans embryogenes 1,23,24. Utöka denna strategi till högre genomströmning, har det nyligen varit möjligt att avslöja ytterligare mönstrings regler och föreslå en metod hur man härleda mönstring regler de novo 10. För många mutanter, men de exakta mönstring defekter är fortfarande okänd. De metoder som beskrivs här ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
