Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em> C. elegans</em> Verwendung von Open-Source-Werkzeuge
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Quantitativen Erfassung von Entwicklungsprozessen ist entscheidend, um mechanistische Modelle und grundlegenden ableiten zu identifizieren und zu beschreiben Mutantenphänotypen. Hier Protokolle werden zur Herstellung von Embryonen und erwachsenen C. vorgestellt elegans Tiere für kurz- und langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie und Methoden zur Überwachung und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen. Die vorgestellten Methoden werden alle auf C basiert elegans Stämme von der Caenorhabditis Genetics Center und auf Open-Source-Software, die leicht in jedem Labor unabhängig von dem Mikroskopiesystem verwendet, implementiert werden kann. Eine Rekonstruktion eines 3D-Zell-Formmodells mit Hilfe der Modellierungssoftware IMOD, manuelle Verfolgung von fluoreszenzmarkierten subzellulärer Strukturen unter Verwendung des Mehrzweck-Bildanalyseprogramm Endrov, und eine Analyse der kortikalen Kontraktionsströmung mit PIVlab (zeitaufgelöste digitale Particle Image Velocimetry Werkzeug für MATLAB) gezeigt. Es wird diskutiert, wie diese Methoden können auch eingesetzt werden to quantitativ erfassen andere Entwicklungsprozesse in verschiedenen Modellen, zum Beispiel Zell Tracking und Tracing Abstammung, Tracking der Vesikel-Flow.
Introduction
Mit den stetigen Verbesserungen der fluoreszierenden Proteine, Genomtechnik, Lichtmikroskopie und Computer Soft- und Hardware, ist es nun möglich, die Entwicklung von vielen Modellorganismen zu beispiellosen räumlich-zeitliche Auflösung aufzeichnen. Dies ermöglicht es den Forschern, um Fragen, die bisher nicht behandelt werden konnten bitten oder zu bekannten Entwicklungsprozesse, um für übersehene Aspekte zu suchen denken. Diese Fortschritte sind auf dem Gebiet der quantitativen Entwicklungsbiologie, die bei Umwandlung qualitative, informellen Modelle in quantitativen Modellen durch gründliche Messungen und statistische Analysen sollen entfacht.
Tracking-Zellen und subzellulären Strukturen hat es möglich gemacht, um quantitative Modelle der Embryonalentwicklung Aktivität des Nervensystems oder der Zellteilung 1-12 abzuleiten. Durch die Verfolgung der Zellteilung Überreste während der frühen Entwicklung des C elegans Embryo, konnten wir kürzlich zeigen, dass sie ein Stereo folgeneingegeben Pfad und stellen wichtige Polarisationsfaktoren 13,14.
Hier werden Protokolle vorgestellt, die quantitative Entwicklungsbiologie Ansätze für Nicht-Experten zugänglich zu machen. Der Fokus liegt auf drei geradlinig, frei verfügbaren Tools, die umsetzbare in jedem Labor, das den Zugang zu Standard-konfokale Mikroskopie und Computer hat, sind. Dazu gehören ein Protokoll, um 3D-Zellformen zu erzeugen, ein Protokoll zur Zellteilung Überreste zu verfolgen, und ein Protokoll, um quantitativ zu beschreiben kortikalen Actomyosin Dynamik. Der Fadenwurm C. elegans wird als beispielhafter Fall verwendet wird, jedoch sind die Verfahren und Instrumente hier beschrieben werden, geeignet für eine Vielzahl von Fragen in anderen biologischen Modellen, beispielsweise kultivierten Zellen, Gewebeexplantate, Organoide oder Sphäroide anderen Embryonen usw.
Im Allgemeinen können einige der hier dargestellten Analysen auch mit dem beliebten Open-Source-Tool ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index durchgeführt werden.html; oder FIJI, 'mitgelieferten Batterien "die Version von ImageJ, http://fiji.sc/Fiji), für die viele Plugins für verschiedene quantitative Analysen zur Verfügung stehen. Allerdings sind die Programme hier diskutiert wurden entwickelt, um spezifische Probleme anzugehen.
Erstens IMOD, eine Bildverarbeitung, Modellierung und Display-Suite für 3D-Rekonstruktionen der Serienschnitte von Elektronen- oder Lichtmikroskop 15 verwendet werden. IMOD enthält auch Werkzeuge für die Anzeige der 3D-Daten aus jeder Ausrichtung. Zweitens Endrov, ein Java-Programm entwickelt, um die Bildanalyse, Datenverarbeitung, und Annotation von Netzwerken oder Spuren (unter anderem) auf der Grundlage eines erweiterten Plugin-Architektur durchzuführen, mit ImageJ Plugin-Kompatibilität 16. Es enthält über 140 Bildverarbeitungsoperationen und eine erweiterbare Benutzeroberfläche, in dem Modell und Rohdaten werden separat angezeigt. Sein Quellcode kann https://github.com/mahogny/Endrov gefunden werden. Drittens PIVlab, a MATLAB Werkzeug für digitale Particle Image Velocimetry, die dem Benutzer erlaubt, quantitativ und qualitativ analysiert Partikelströmungsfelder 17. Die Verwendung dieser Programme erfordert eine MATLAB-Lizenz, die die Image Processing Toolbox (http://mathworks.com) umfasst. PIVlab ist ein Programm entwickelt, um quantitativ zu beschreiben Fluss. Es berechnet die Geschwindigkeitsverteilung, Größe, Wirbel, Divergenz oder Scher innerhalb von Bildpaaren oder Serie. Hierfür einen kreuzkorreliert kleine Bereiche von Bildern (als "Durchgänge" in dem Protokollabschnitt) eines Bildpaares, um die wahrscheinlichste Teilchenverschiebung abzuleiten. Diese Kreuzkorrelation ergibt einen Korrelationsmatrix, die in dem oder den Frequenzbereich unter Verwendung von entweder direkten Kreuzkorrelation oder einer schnellen Fourier-Transformation (FFT) bzw. ausgewertet werden können.
Das hier verwendete Ausrüstung ist ein inverses Mikroskop mit einer Nipkow ('Spinning') Disc, einer EMCCD, 488 und 561 nm Standard Fest- ausgestattetKörperlaser und 20x Luft oder 40x oder 60x Plan / Apochromat auf Öl- oder Wasserimmersionsobjektive. Es ist jedoch auch möglich, Zeitraffer-Bildgebung in Verbindung mit anderen Bildgebungsverfahren durchführen, beispielsweise punkt-, linien- oder flächen Scanning Laser basierende Mikroskopie, Multi-Photonen-Mikroskopie sowie Epifluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Dekonvolution oder strukturierte Erleuchtung. Der Vorteil der Verwendung einer Nipkow-Scheibe-System ist die extrem schnelle Bildaufnahme, insbesondere wenn eine Streaming-Betrieb (kontinuierlicher Bewegung und Abtastung des Objekts in der z-Richtung) ist verfügbar. Darüber hinaus, um die Auflösung zu verbessern, kann ein 1,5-fach Vergrößerungs Extender vor dem EMCCD verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durch Objektverfolgung in der Entwicklung, insbesondere Kern Tracking, ist es gelungen, den zentralen Mustermechanismen aufzuklären C. elegans Embryogenese 1,23,24. Der Ausbau dieser Strategie um einen höheren Durchsatz, hat es vor kurzem gelungen, zusätzliche Strukturierungsregeln aufzudecken und schlagen eine Methode, wie man Strukturierungsregeln ableiten, De-novo-10. Für viele Mutanten sind jedoch die präzise Strukturierung Defekte noch unbekannt. Die hier beschriebenen M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
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