アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
アレナウイルスは、自然界1-3のげっ歯類で主に維持されている包まれ、一本鎖RNAウイルスのファミリーです。これらのウイルスは、通常、齧歯類貯水池1,2に無症候性、持続感染を確立しているが、それらは、ヒト3に重篤な疾患を引き起こす可能性があります。重要な病原性の種は、新世界フニンウイルス（JUNV）4とそれぞれアルゼンチン南米出血熱、アフリカのラッサ熱の病因剤である旧世界ラッサウイルス5が含まれます。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、家族6の原型ウイルスは、世界的な分布を持っており、免疫抑制における免疫応答性個体6で無菌性髄膜炎、胎児7に重篤な先天性欠損、または高い致死率を含む種々の疾患状態の原因であります固形臓器移植8,9を以下の個人。米国の欠如これらのウイルスに対抗するための食品医薬品局（FDA）が承認したワクチンや有効な抗ウイルス薬は、治療これらの新興/再新興病原体を標的とする新たな戦略を開発するための重要な必要性を強調しています。
アレナウイルスのゲノムは、2つの一本鎖RNAセグメント、大（L）（〜7.2キロバイト）と小（S）（〜3.6キロバイト）セグメント10から構成されています。 Lセグメントはウイルスポリメラーゼ（L）、およびマトリックスタンパク質（Z）をコードしながら、Sセグメントはウイルス核タンパク質（NP）およびエンベロープ糖タンパク質（GP）をコードします。 LとSのゲノムRNAセグメント（のvRNA）は、ビリオン10-12にパッケージ化されています。アレナウイルス感染の初期段階は、ウイルス粒子の付着はJUNVのために、ヒトトランスフェリン受容体1（hTfR1）13,14を含み、ウイルスGPとそれに対応する宿主細胞受容体との間の相互作用を介して細胞をホストすることです。添付ファイルの後、JUNV粒子はクラスリン依存性エンドサイトーシス15を介して細胞内に取り込まれます。その後、粒子このコンパートメントの低pHはGP 16,17の活性化を誘発後期エンドソームへのトラフィック。いったんウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、エンドソーム膜に、GP-コードされる融合ペプチド挿入を活性化しました。彼らは、ゲノムの複製および転写のための鋳型としての役割を果たす細胞質内へのビリオンにパッケージのvRNAのリリースで成功融合結果。ウイルス構造タンパク質とのvRNAの十分な量が生成されると、新しい粒子がライフサイクル18を完了するために感染細胞からアセンブルし芽。
治療的に病原性アレナウイルスを標的とするために新たな戦略の発見を容易にするために、当社グループは、ホスト用のウイルス増殖のために重要な、しかし必須では宿主因子の同定に焦点を当ててきました。この文脈において、そのような宿主因子によって制御されるウイルスのライフサイクルの正確なステージ（複数可）を定義する案内することが必要です抗ウイルス戦略の開発。ここで、我々は、選択された宿主タンパク質および/ または抗ウイルス性分子がウイルス侵入19のこの初期の段階に影響を与えるかどうかを識別するためにアレナウイルス-細胞接着を測定するために使用することができる定量的（q）はRT-PCRに基づくアッセイを記載します。アレナウイルス-細胞付着を測定するための別のアプローチは、ビオチン20で標識されたビリオン、蛍光染料21、または放射性同位元素22を特色にしています。これらの方法の欠点は、入力されたウイルスの大量の要求（感染の例えば、高多重度（MOI））、放射能の使用、および/ または入力ウイルスを調製するための追加の処理工程（ 例えば、濃度および/ またはウイルスの標識）を含むことができます。特に、高いMOIを用いることが困難な非生産添付イベント15,23対生産性を区別することができます。ここに記載のqRT-PCRに基づくアッセイは、20プラークとしていくつかを使用して、添付イベントを検出することができます。48ウェルプレートのために0.0004のMOIに変換ウイルスの明単位（PFUの）、。したがって、アッセイの強い感度が高いMOIの要件だけでなく、任意のウイルス標識または濃縮工程を克服します。さらに、アッセイは、ⅰ）融合後のビリオンのエンドサイトーシスと同様に細胞質へのウイルスゲノムの放出を測定するように構成することができると、ii）参照、例のために（ウイルス特異的定量RT-PCR試薬の開発を通じて、他のウイルスで使用するために仕立て24-27）。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちが説明するプロトコルは簡単であり、堅牢では、次の重要な考慮事項が観察されました。まず、厳格な事前-PCR法は、（優れたレビューのために28を参照） を使用しなければなりません。すべての試薬および装置は定量PCR標的配列を含む増幅されたDNAを含まないと、適切なコントロールは、このような汚染を検出するための場所にあることが肝要です。第二に、プロト?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、助成金T32 AI055402（JK）、R21 AI088059（JB）、およびP20RR021905（JB）を介してこれらの研究をサポートするために役立つ議論や国立衛生研究所のためにマルクス・ターリー、ネイサンロイ、クリストファー・ツィーグラー、エミリーブルース、とベンジャミン王に感謝します。
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
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