The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Arenaviruses er en familie av kappe, enkelt-trådet RNA-virus som opprettholdes hovedsakelig i gnagere i naturen 1-3. Mens disse virusene vanligvis etablere en asymptomatisk, vedvarende infeksjon i gnagere reservoarer 1,2, kan de forårsake alvorlig sykdom hos mennesker 3. Viktige patogene artene omfatter den nye verden Junin virus (JUNV) 4 og den gamle verden Lassa virus 5, som er de etiologiske av argentinske hemoragisk feber i Sør-Amerika og Lassa feber i Afrika, henholdsvis. Lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV), det prototypiske virus av familien 6, har en verdensomspennende distribusjon, og er ansvarlig for en rekke sykdomstilstander inkludert aseptisk meningitt hos immunkompetente individer 6, alvorlige misdannelser hos fosteret 7, eller høy dødelighet hos immunsupprimerte individer følgende solid organtransplantasjon 8,9. Mangelen på USAFood and Drug Administration (FDA) -godkjent vaksiner eller effektive antivirale å bekjempe disse virusene streker kritisk behov for å utvikle nye strategier for å terapeutisk målrette disse nye / re-fremvoksende patogener.
Den arenavirus-genomet består av to enkelt-trådede RNA-segmenter, den store (L) (~ 7,2 kb) og små (S) (~ 3,6 kb) segmenter 10. S-segment koder for det virale nukleoprotein (NP) og kappe-glykoproteinet (GP), mens L-segment koder for det virale polymerase (L) og matriseprotein (Z). L og S genomiske RNA segmenter (vRNAs) er pakket inn i viruspartikler 10-12. Det første trinnet av arenavirus infeksjon er festet av viruspartikler vertsceller gjennom et samspill mellom viral GP, og tilsvarende vertscellereseptorer som for JUNV, omfatter den menneskelige transferrin reseptor 1 (hTfR1) 13,14. Etter vedlegg, er JUNV partikler tatt inn i cellen via clathrin endocytose 15.Partikler da trafikk til slutten endosomet hvor lav pH i dette kammeret utløser aktiveringen av GP 16,17. Når aktivert, GP-kodet fusjon peptid innsatser inn i endosomal membranen, initiere fusjon mellom de virale og endosomal membraner. Vellykket fusjon resulterer i utslipp av virion-pakket vRNAs inn i cytoplasma, der de tjener som maler for genomisk replikasjon og transkripsjon. Når tilstrekkelige mengder av virale strukturelle proteiner og vRNAs er generert, nye partikler samle bud og fra den infiserte celle for å fullføre livssyklus 18.
For å lette oppdagelsen av nye strategier for å terapeutisk målrette patogene arenaviruses, har vår gruppe fokusert på identifisering av vertsfaktorer som er kritiske for virus forplantning, men unnværlig for verten. I denne sammenheng, å definere den nøyaktige trinn (e) av den virale livssyklus styrt ved hjelp av slike vertsfaktorer er nødvendig for å ledeutvikling av antivirale strategier. Heri beskriver vi en kvantitativ (q) RT-PCR-basert assay som kan brukes til å måle arenavirus-cellefesting med det formål å identifisere om utvalgte vertsproteiner og / eller antiviral-molekyler påvirke denne innledende fasen av viral inngang 19. Alternative metoder for å måle arenavirus-cellebinding har omtalt virions merket med biotin 20, fluorescerende fargestoffer 21, eller radioaktive isotoper 22. Ulemper til disse metodene kan omfatte behovet for store mengder av inngangsvirus (f.eks høye multiplisiteter av infeksjon (MOI)), bruk av radioaktiviteten, og / eller ytterligere håndteringstrinn for å klarinngangen virus (f.eks konsentrasjon og / eller etikettering av virus) . Spesielt bruk av høy MOI gjør det vanskelig å skille produktiv versus nonproductive feste hendelser 15,23. Den QRT-PCR-basert analysen beskrevet her kan oppdage feste hendelser ved hjelp av så få som 20 plakett forming enheter (PFUs) av virus, noe som tilsvarer en MOI på 0,0004 for en 48-brønns plate. Derfor overvinner den sterke følsomheten til analysen kravet om høy MOI samt eventuelle virus merking eller konsentrasjonstrinn. Videre kan analysen være i) innrettet til å måle virion endocytose, så vel som frigjøring av virus-genomet inn i cytoplasma etter fusjon og ii) tilpasset for bruk sammen med andre virus gjennom utviklingen av virus-spesifikke QRT-PCR-reagenser (for eksempel, se 24-27).
Protokollen vi beskriver er enkel og robust dersom følgende kritiske betraktninger er observert. Først må strenge pre-PCR teknikk benyttes (se 28 for en utmerket vurdering). Det er viktig at alle reagenser og utstyr er gratis amplifisert DNA inneholder qPCR målsekvensen og at nødvendige kontroller er på plass for å avdekke slik forurensning. For det andre, for virus-cellefesting del av protokollen, virus, celler og media må holdes ved 4 ° C for å forhindre endocytose av overflatebundet virioner. For…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, og Benjamin King for nyttige diskusjoner og National Institutes of Health for støtte av disse studiene gjennom tilskudd T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), og P20RR021905 (JB) .
DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |