Summary

Svært sensitiv analyse for måling av arenavirus-celle vedlegg

Published: March 02, 2016
doi:

Summary

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Abstract

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

Introduction

Arenaviruses er en familie av kappe, enkelt-trådet RNA-virus som opprettholdes hovedsakelig i gnagere i naturen 1-3. Mens disse virusene vanligvis etablere en asymptomatisk, vedvarende infeksjon i gnagere reservoarer 1,2, kan de forårsake alvorlig sykdom hos mennesker 3. Viktige patogene artene omfatter den nye verden Junin virus (JUNV) 4 og den gamle verden Lassa virus 5, som er de etiologiske av argentinske hemoragisk feber i Sør-Amerika og Lassa feber i Afrika, henholdsvis. Lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV), det prototypiske virus av familien 6, har en verdensomspennende distribusjon, og er ansvarlig for en rekke sykdomstilstander inkludert aseptisk meningitt hos immunkompetente individer 6, alvorlige misdannelser hos fosteret 7, eller høy dødelighet hos immunsupprimerte individer følgende solid organtransplantasjon 8,9. Mangelen på USAFood and Drug Administration (FDA) -godkjent vaksiner eller effektive antivirale å bekjempe disse virusene streker kritisk behov for å utvikle nye strategier for å terapeutisk målrette disse nye / re-fremvoksende patogener.

Den arenavirus-genomet består av to enkelt-trådede RNA-segmenter, den store (L) (~ 7,2 kb) og små (S) (~ 3,6 kb) segmenter 10. S-segment koder for det virale nukleoprotein (NP) og kappe-glykoproteinet (GP), mens L-segment koder for det virale polymerase (L) og matriseprotein (Z). L og S genomiske RNA segmenter (vRNAs) er pakket inn i viruspartikler 10-12. Det første trinnet av arenavirus infeksjon er festet av viruspartikler vertsceller gjennom et samspill mellom viral GP, og tilsvarende vertscellereseptorer som for JUNV, omfatter den menneskelige transferrin reseptor 1 (hTfR1) 13,14. Etter vedlegg, er JUNV partikler tatt inn i cellen via clathrin endocytose 15.Partikler da trafikk til slutten endosomet hvor lav pH i dette kammeret utløser aktiveringen av GP 16,17. Når aktivert, GP-kodet fusjon peptid innsatser inn i endosomal membranen, initiere fusjon mellom de virale og endosomal membraner. Vellykket fusjon resulterer i utslipp av virion-pakket vRNAs inn i cytoplasma, der de tjener som maler for genomisk replikasjon og transkripsjon. Når tilstrekkelige mengder av virale strukturelle proteiner og vRNAs er generert, nye partikler samle bud og fra den infiserte celle for å fullføre livssyklus 18.

For å lette oppdagelsen av nye strategier for å terapeutisk målrette patogene arenaviruses, har vår gruppe fokusert på identifisering av vertsfaktorer som er kritiske for virus forplantning, men unnværlig for verten. I denne sammenheng, å definere den nøyaktige trinn (e) av den virale livssyklus styrt ved hjelp av slike vertsfaktorer er nødvendig for å ledeutvikling av antivirale strategier. Heri beskriver vi en kvantitativ (q) RT-PCR-basert assay som kan brukes til å måle arenavirus-cellefesting med det formål å identifisere om utvalgte vertsproteiner og / eller antiviral-molekyler påvirke denne innledende fasen av viral inngang 19. Alternative metoder for å måle arenavirus-cellebinding har omtalt virions merket med biotin 20, fluorescerende fargestoffer 21, eller radioaktive isotoper 22. Ulemper til disse metodene kan omfatte behovet for store mengder av inngangsvirus (f.eks høye multiplisiteter av infeksjon (MOI)), bruk av radioaktiviteten, og / eller ytterligere håndteringstrinn for å klarinngangen virus (f.eks konsentrasjon og / eller etikettering av virus) . Spesielt bruk av høy MOI gjør det vanskelig å skille produktiv versus nonproductive feste hendelser 15,23. Den QRT-PCR-basert analysen beskrevet her kan oppdage feste hendelser ved hjelp av så få som 20 plakett forming enheter (PFUs) av virus, noe som tilsvarer en MOI på 0,0004 for en 48-brønns plate. Derfor overvinner den sterke følsomheten til analysen kravet om høy MOI samt eventuelle virus merking eller konsentrasjonstrinn. Videre kan analysen være i) innrettet til å måle virion endocytose, så vel som frigjøring av virus-genomet inn i cytoplasma etter fusjon og ii) tilpasset for bruk sammen med andre virus gjennom utviklingen av virus-spesifikke QRT-PCR-reagenser (for eksempel, se 24-27).

Protocol

Merk: Det er viktig at den beskrevne protokollen utføres ved hjelp av strenge pre-PCR-teknikk (se 28 for en god oversikt om hvordan du setter opp en pre-PCR laboratorium og hvordan gjennomføre eksperimenter ved hjelp av god pre-PCR teknikk). Det er viktig at alle reagenser og utstyr er gratis amplifisert DNA inneholder qPCR målsekvensen og at nødvendige kontroller er på plass for å avdekke slik forurensning. En oversikt av protokollen er vist i figur 1. 1. Forbered Media og Seed c…

Representative Results

For å demonstrere følsomheten og dynamisk område for qPCR-analyse, ble kjente mengder av et plasmid som koder for NP-genet av JUNV C # 1 (område 5-5 x 10 7 eksemplarer) kastet qPCR som beskrevet i del 4 av protokollen. Analysen er følsomme og kan på en pålitelig detektere så få som 5 kopier av målnukleinsyren (figur 2). Dessuten er det dynamiske området av analysen stor og, som vist i figur 2, kan dekke minst 7 logger av malen. Selv…

Discussion

Protokollen vi beskriver er enkel og robust dersom følgende kritiske betraktninger er observert. Først må strenge pre-PCR teknikk benyttes (se 28 for en utmerket vurdering). Det er viktig at alle reagenser og utstyr er gratis amplifisert DNA inneholder qPCR målsekvensen og at nødvendige kontroller er på plass for å avdekke slik forurensning. For det andre, for virus-cellefesting del av protokollen, virus, celler og media må holdes ved 4 ° C for å forhindre endocytose av overflatebundet virioner. For…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, og Benjamin King for nyttige diskusjoner og National Institutes of Health for støtte av disse studiene gjennom tilskudd T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), og P20RR021905 (JB) .

Materials

DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

References

  1. Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
check_url/53682?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

View Video